[发明专利]用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法

说明书

本发明提供了一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法，旨在解决采用现有的培养基培养的人工胸腺类器官主要停留在T细胞发育早期阶段的问题。培养基制备方法，包括：将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶；将滋养细胞与微气泡凝胶按照体积比为1∶1‑1∶10的比例混合；所述滋养细胞包括两株体积比为1∶1‑1∶4的OP9‑DLL1细胞和MS5‑DLL1细胞；滋养细胞OP9‑DLL1、滋养细胞MS5‑DLL1与微气泡凝胶的结合，可以使T细胞的发育到达成熟的阶段。

技术领域

本发明属于胸腺类器官培养技术领域，具体涉及一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法。

背景技术

胸腺T细胞发育的场所。来源于骨髓(Bone marrow，BM)的共同淋巴祖细胞(Commonlymphoid progenitors，CLPs)随血液循环进入胸腺，在皮质胸腺上皮细胞(Corticalthymic epithelial cells，cTECs)和髓质胸腺上皮细胞(Medullary thymic epithelialcells，mTECs)指导下，经历T细胞受体-β(T cell receptor，TCR-β)选择、阳性选择(Positive selection)和阴性选择(Negative selection)等过程后分化为初始T细胞(Naive T cell)。

经典的T细胞二维培养方法既不能模拟cTECs和mTECs形成的三维(Three-dimensional，3D)结构，也不能完全满足正常T细胞发育对趋化因子和细胞因子的需求，因此无法培养出具有自身耐受性(Self-tolerant)和自身限制性(Self-restricted)的T细胞。

体外研究需要采用立体结构模拟胸腺基质的微结构。胸腺类器官在一定程度上重现了机体cTECs和mTECs的微环境，使T细胞的体外分化更贴近体内分化过程。胸腺类器官不仅能够长期传代培养，而且其表型和遗传学特性比二维培养产物更加稳定，在模拟器官组织的发生过程及生理病理状态方面优势突出。

现有的胸腺类器官培养方法是基于细胞系的细胞来构建，或者是利用来自动物模型的胸腺组织进行体外培养，整个过程较为复杂，所用的培养基中需要添加十几种的细胞因子、调控因子，均需要在使用时进行溶解配制，一方面容易产生污染和配制误差，另一方面，随着细胞生物学技术的发展以及新的细胞生长调控信号通路的发现，需要对原有的培养基配方进行持续改进，并且一般的培养基培养成功率较低(低于70％)、培养时间长(6～8周时间)，操作步骤繁琐。

发明内容

本发明提供了一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法，旨在解决采用现有的培养基培养的人工胸腺类器官主要停留在T细胞发育早期阶段的问题。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，包括：

S100、将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；

S200、向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶；

S300、将滋养细胞与微气泡凝胶按照体积比为1:1-1:10的比例混合；

所述滋养细胞包括两株体积比为1:1-1:4的OP9-DLL1细胞和MS5-DLL1细胞。

进一步改进的方案：在步骤S100中，所述将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶的步骤具体包括：