[发明专利]用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法在审
申请号: | 202210847400.0 | 申请日: | 2022-07-19 |
公开(公告)号: | CN115161279A | 公开(公告)日: | 2022-10-11 |
发明(设计)人: | 王一飞;王运生 | 申请(专利权)人: | 杭州准星医学科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/0783 | 分类号: | C12N5/0783;C12N5/0789 |
代理公司: | 杭州知学知识产权代理事务所(普通合伙) 33356 | 代理人: | 何红信 |
地址: | 310000 浙江省杭州*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 用于 培养 胸腺 器官 培养基 制备 方法 | ||
1.一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法,其特征在于,包括:
S100、将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶,搅拌形成微球形的凝胶;
S200、向凝胶内加入空气,使凝胶内均匀布满微米级气泡;静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡,并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中,得到微气泡凝胶;
S300、将滋养细胞与微气泡凝胶按照体积比为1:1-1:10的比例混合;
所述滋养细胞包括两株体积比为1:1-1:4的OP9-DLL1细胞和MS5-DLL1细胞。
2.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法,其特征在于,在步骤S100中,所述将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶的步骤具体包括:
将Pluronic F127用超纯水溶解得到Pluronic F127溶液;透明质酸用超纯水溶解得到透明质酸溶液;
将Pluronic F127溶液加入到透明质酸溶液中,然后用聚乙二醇400将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇400的总质量分数补足至100%;
其中,所述Pluronic F127的质量分数为5%-45%,所述透明质酸的质量分数为30%-60%;
所述质量分数为每100ml中所包含的克数。
3.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法,其特征在于,在步骤S100中,所述搅拌形成微球形的凝胶的步骤具体包括:300-1500g/min的搅拌速度磁力搅拌2小时,形成粒径大于100um的球形的凝胶。
4.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法,其特征在于,在步骤S200中,所述向凝胶内加入空气,使凝胶内均匀布满微米级气泡;静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡,并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中,得到微气泡凝胶的步骤具体包括:
通过鼓泡法向凝胶内以100-250mL/min的气流速度加入空气2-8小时,使凝胶内均匀布满微米级气泡,静置10h-24h使微米级气泡逐渐过度为10-100nm的纳米级气泡,并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中,形成空气饱和的微气泡凝胶。
5.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法,其特征在于,在步骤S200和步骤S300之间,还包括将微气泡凝胶导入搅拌池中以5000-10000g/min进行搅拌,使微气泡凝胶中气泡稳定的步骤。
6.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法,其特征在于,所述滋养细胞包括滋养细胞本体和用于培养滋养细胞的滋养细胞培养基。
7.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法,其特征在于,所述滋养细胞培养基为DMEM-F12培养基。
8.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法,其特征在于,所述OP9-DLL1细胞和MS5-DLL1细胞体积比为1:1、1:2、1:3或1:4。
9.一种胸腺类器官的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
从人骨髓、小鼠骨髓或人脐带血中提取并依次经过磁珠细胞分选和流式细胞分选获取造血干细胞;
在transwell小室的上室放置权利要求1-8任一所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法制备的培养基,在transwell小室的下室放置滋养细胞培养基;
将造血干细胞在上室中权利要求1-8任一所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法制备的培养基上培养。
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