[发明专利]一种凌云牛心李分子鉴定方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种凌云牛心李分子鉴定方法，该方法包括以下步骤：(1)基因组DNA提取；(2)ITS序列引物合成；(3)ITS序列PCR扩增；(4)ITS序列特异位点分析；(5)基于ITS序列的亲缘关系分析。本发明相比较于matK及rbcL序列，ITS序列的变异位点更为丰富，进化速率较快，遗传差异较大，更适宜用于凌云牛心李种间和种内的分子鉴定和亲缘关系分析；并且还采用DNA分子鉴定技术，相比于传统的形态学鉴定方法，快速有效，耗时短，重复性好，省时省力效率高，对于凌云牛心李种质资源的保护以及优良性状的传承具有重要的现实意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种凌云牛心李分子鉴定方法。

背景技术

凌云牛心李是蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.)栽培中国李(Prunus salicinaLindl.)的一个地方优良品种，产于凌云加尤，因其果形似牛心而得名。凌云牛心李口味独特，清脆香甜，风味品质极佳，是区别于其他李品种的一项重要品质特征，这也是其属稀缺果品，深受消费者喜爱的原因之一。凌云牛心李于2015年获得农产品地理标志保护登记，是凌云县重要的特色农业产业。前期调查研究发现，由于多年连续种植，凌云牛心李出现了不同程度的品种自然退化现象，加之苗木市场的混杂，导致凌云牛心李产业出现产量降低、品质下降、品种不纯正等问题。因此，亟需开展凌云牛心李分子鉴定技术及亲缘关系分析，解决当前存在的品种退化、苗木不纯正、产量下降、品质降低等产业共性问题，对于凌云牛心李种质资源的保护以及优良性状的传承具有重要的现实意义。

DNA条形码(DNAbarcoding)技术以一段标准DNA序列作为标记实现快速、准确和自动化的物种鉴定方法，植物DNA条形码常用的有ITS、matK、rbcL和trnH-psbA等基因序列，这些基因序列除物种鉴定功能外，还有助于发现新种和隐种。

当前，植物DNA条形码技术在部分中国李品种的分子系统发育树构建及亲缘关系研究方面已有相关研究报道，如李斌等(2016)采用植物DNA条形码标准序列ITS、matK及rbcL对包括槜李在内的22个李品种(或品系)进行PCR扩增、序列比对及进化树分析，获得了槜李的分子鉴定方法及其亲缘关系，对于槜李的种质资源保护具有重要意义。而关于凌云牛心李的分子鉴定相关研究尚未见报道，本技术发明拟利用植物DNA条形码标准序列ITS、matK及rbcL，对包括9份凌云牛心李在内的13份李种质资源进行序列比对并构建进化树进行亲缘关系分析，研究凌云牛心李的分子鉴定方法及其亲缘关系，旨在对凌云牛心李的种质资源保护提供技术支撑。

发明内容

为实现上述目的，本发明通过克隆获得了13份李种质资源的核糖体DNA内转录间隔区ITS序列和叶绿体基因组rbcL和matK基因序列，经序列差异比对分析，建立了一种基于ITS序列快速有效的凌云牛心李分子鉴定方法。

本发明提供了一种凌云牛心李分子鉴定方法，该方法包括以下步骤：

(1)基因组DNA提取；

(2)ITS序列引物合成；

(3)ITS序列PCR扩增；

(4)ITS序列特异位点分析；

(5)基于ITS序列的亲缘关系分析。

优选地，基因组DNA提取具体包括以下步骤：

(1)采用植物基因组DNA提取试剂盒提取叶片总DNA；

(2)用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量；

(3)DNA全部稀释至终质量浓度40mg·L^-1后置于-20℃冰箱保存备用。

优选地，ITS序列引物合成具体为：

ITS-F：5’-GTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’，