[发明专利]一种凌云牛心李分子鉴定方法

权利要求书

1.一种凌云牛心李分子鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)基因组DNA提取；

(2)ITS序列引物合成；

(3)ITS序列PCR扩增；

(4)ITS序列特异位点分析；

(5)基于ITS序列的亲缘关系分析。

2.根据权利要求1所述的一种凌云牛心李分子鉴定方法，其特征在于，基因组DNA提取具体包括以下步骤：

(1)采用植物基因组DNA提取试剂盒提取叶片总DNA；

(2)用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量；

(3)DNA全部稀释至终质量浓度40mg·L-1后置于-20℃冰箱保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种凌云牛心李分子鉴定方法，其特征在于，ITS序列引物合成具体为：

ITS-F：5’-GTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’，

ITS-R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

4.根据权利要求1所述的一种凌云牛心李分子鉴定方法，其特征在于，ITS序列PCR扩增具体包括：

PCR扩增反应体系为：40μL，含2×MasterMix20μL、上下游引物(10μmol·L^-1)各1μL、DNA模板1μL、ddH₂O17μL；

PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min；然后95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸45s，共36个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

5.根据权利要求1所述的一种凌云牛心李分子鉴定方法，其特征在于，ITS序列特异位点分析具体包括以下步骤：

(1)进行目的片段的回收，然后将回收的DNA片段连接到pGEM-Teasy载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；

(2)然后涂布于含IPTG、X-gal和Amp的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取白斑；

(3)通过M13引物PCR扩增检测T-easy载体中是否携带有目的片段；

(4)最后将含有目的DNA片段的菌液进行序列测定。

6.根据权利要求1所述的一种凌云牛心李分子鉴定方法，其特征在于，基于ITS序列的亲缘关系分析具体包括以下步骤：

(1)将测序获得的ITS序列在NCBI数据库进行Blast序列比对；

(2)用DNAMAN软件进行多重序列比对分析，并辅以人工校对，进行序列变异位点分析；

(3)然后用MEGA6.0软件中邻接法(neighbor-joining，NJ)构建NJ系统进化树；

(4)得出各种质之间的遗传分歧，并分析种间和种内的亲缘关系。