[发明专利]一种小鼠颈动脉血管组织单细胞悬液的制备方法及其应用

说明书

本发明公开一种小鼠颈动脉血管组织单细胞悬液的制备方法，将小鼠颈动脉组织剪碎后加入解离工作液RA消化1小时，然后离心去除上清后，再加入解离工作液RB，最终离心获得高质量的单细胞悬液。本发明还提供了一种利用所述的制备方法在单细胞测序和流式检测相关领域中的应用。本发明的有益效果：本发明提供了一种用于单细胞测序的小鼠颈动脉血管组织单细胞悬液制备方法及应用，具体涉及使用多种类型组织消化酶对小鼠颈动脉组织进行分步式消化从而把控组织解离程度以获得高质量的单细胞悬液进行单细胞测序，从而大幅增加单细胞测序和流式检测技术的可行性与精确性，推动多种疾病的临床诊断和理论机制研究，该发明具有重要的应用前景和推广价值。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种小鼠颈动脉血管组织单细胞悬液的制备方法及其应用。

背景技术

近年来，随着测序技术的高速发展，用于揭示细胞异质性的单细胞转录组测序技术如10×Genomics等应运而生。其在单细胞水平对RNA进行高通量测序和分析，检测细胞全基因组范围内所有基因的表达情况，在肿瘤、神经发育、心血管疾病和免疫学等领域均得到了一定的运用。进行单细胞测序往往需要将实体组织解离成高质量的单细胞悬液，然而，由于不同的组织具有不同的生理特性，所以在使用常规解离方法制备单细胞悬液时常常出现细胞活率低、细胞数量少，细胞碎片多等影响单细胞捕获的多种问题。因此，发明针对不同组织的消化方法，制备高质量的单细胞悬液在肿瘤和心血管等研究领域中具有重要意义。

目前常使用酶消化法即用胶原酶或者弹性蛋白酶等对小鼠血管组织进行单细胞悬液的制备。其通过对组织中的弹性纤维和胶原纤维进行降解，进而破坏细胞与细胞间负责紧密连接的蛋白，从而达到解离细胞的目的。然而，不同的组织具有不同的生理特性，以往的发明专利如CN111621466A和CN107748130A等是针对小鼠心脏和肺动脉等组织的单细胞悬液制备，而专门针对小鼠颈动脉血管组织的消化方法还尚未有报道。

现有技术往往采取单一的解离方式且很难在小鼠颈动脉组织的消化中发挥良好的作用。单纯同时使用如胶原酶或者胰蛋白酶对组织进行消化很难实时掌控细胞消化的效果，容易造成细胞消化不彻底或者细胞消化过度，从而导致单细胞悬液制备的失败，因此发明一种使用多种类型酶进行分步式消化的方法将有利于获得高质量的单细胞悬液，从而大幅增加单细胞测序和流式检测技术的可行性与精确性，推动多种疾病的临床诊断和理论机制研究。

发明内容

为解决以上现有技术的缺点，本发明提供一种小鼠颈动脉血管组织单细胞悬液的制备方法及其应用。本发明通过以下技术方案实现。

一种小鼠颈动脉血管组织单细胞悬液的制备方法，包含如下过程：

S1：小鼠麻醉后使用预冷的PBS进行心脏灌流，剔除颈动脉周围组织；

S2：将颈动脉纵向剖开，放入含1.5％FBS的六孔板中；

S3：用手术剪刀将每根颈动脉血管剪成约为2mm²的4段，吸入1.5mL EP管中，2000rpm离心5分钟以沉淀血管组织；

S4：用HBSS溶液配制1mL组织解离RA工作液；

S5：每管加入500μL解离工作液，放入37℃水浴锅中加热解离1小时；

S6：每间隔10分钟使用1mL移液枪吹打一次；

S7：1小时后加入500μL 5％FBS混匀，使用40μm滤器进行过滤；

S8：放入离心机中，1000rpm离心5分钟；

S9：吸弃上清后加入200μL组织解离RB工作液；

S10：放入37℃水浴锅消化5分钟，期间每隔1分钟轻轻吹打一次；

S11：使用200μL 5％FBS终止消化，1000rpm离心5分钟；