[发明专利]一种定量检测KRAS基因突变的引物探针组合及其应用

说明书

本发明公开了一种定量检测KRAS基因突变的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合包括定量检测KRAS基因突变的引物和探针，所述探针包括KRAS基因的野生型探针、KRAS基因的G12D突变位点、G12S突变位点和G13D突变位点的突变探针。本发明针对KRAS基因设计引物、野生型探针及突变探针，协同配合并能够基于数字PCR同时对KRAS基因的3种热点突变(p.G12D、p.G12S和p.G13D)进行分型与定量检测，具备良好特异性和灵敏度，且检测过程操作简便、成本低。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种定量检测KRAS基因突变的引物探针组合及其应用。

背景技术

KRAS基因在EGFR信号传导通路下游RAS-RAF-MEK-ERK途径和PI3K-AKT-mTOR途径中起到分子关卡的作用，与肿瘤的发生发展息息相关。KRAS基因的突变会直接影响针对EGFR基因的抗肿瘤药物的疗效，进行癌症患者基因突变状态的检测与分析，对临床用药及治疗方案指导具有重要意义。

目前检测KRAS基因突变的方法主要有2种：荧光定量PCR法和测序法。直接测序法存在检测灵敏度不足、操作繁琐、无法进行多突变同时检测等缺点。大部分商用的试剂盒依赖于ARMS-qPCR技术，难以进行突变的定量分析，如CN106636442A公开了一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：KRAS基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液，能同时检测人类肿瘤的多种驱动基因的突变位点。CN110684849A公开了一种基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物探针组、试剂盒及方法。其中，引物探针组包括检测KRAS基因2号外显子上第12号、第13号密码子突变位点的引物及探针，其中，各突变位点分别为：G12D、G12V、G12A、G12C、G12S、G12R以及G13D。

综上所述，提供一种定量检测KRAS基因中多个突变热点试剂盒，对于肿瘤基因检测领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种定量检测KRAS基因突变的引物探针组合及其应用，设计特定序列的引物探针组合，协同配合，可基于数字PCR，能够同时对KRAS基因的3种热点突变(p.G12D、p.G12S和p.G13D)进行分型与定量检测，具备良好特异性和灵敏度，且操作简便、成本低。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种定量检测KRAS基因突变的引物探针组合，其所述引物探针组合包括定量检测KRAS基因突变的引物和探针，所述探针包括KRAS基因的野生型探针、KRAS基因的G12D突变位点、G12S突变位点和G13D突变位点的突变探针，所述KRAS基因的上游引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列，下游引物的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列，所述KRAS基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列，所述KRAS基因的G12D突变位点的突变探针的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列，所述KRAS基因的G12S突变位点的突变探针的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列，所述KRAS基因的G13D突变位点的突变探针的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。

本发明中，针对KRAS基因设计引物、野生型探针及突变探针，协同配合并能够基于数字PCR同时对KRAS基因的3种热点突变(p.G12D、p.G12S和p.G13D)进行分型与定量检测，具备良好特异性和灵敏度。

SEQ ID NO.1：5’-AAGGCCTGCTGAAAATGACT-3’。

SEQ ID NO.2：5’-GTCCTGCACCAGTAATATGC-3’。

SEQ ID NO.3：5’-TGGAGCTGGTGGCGT-3’。