[发明专利]一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的基因修饰小鼠的制备方法

说明书

本发明提供了一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方法，包括设计和构建Tbx1 201和203可变剪切体的靶向载体的步骤，选择Tbx1 201和203一号内含子作为编辑位点，通过显微注射将靶向载体、guide RNA和Cas9蛋白共同注入小鼠受精卵中。本发明的基因修饰小鼠，能够准确区分Tbx1的两种剪切体，Tbx1 203突变纯合型小鼠心脏流出道发育存在明显缺陷，这为揭示Tbx1两种可变剪切体在先天性心脏病发生过程的作用机制提供了可靠的动物模型。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方法。

背景技术

早期心脏发育缺陷是导致早期胚胎死亡的最主要原因，占人类胚胎和早期胎儿死亡病例的30%。先天性心脏病发病机制模型的研究为解决越来越复杂的生物学难题提供了保证，同时也避免了伦理道德和技术限制的部分难题。小鼠非常适合作为先天性心脏病发病机制的动物模型，因为小鼠心脏发育过程与人类胚胎发育过程高度相似，它们和人类一样具有四腔室结构，且繁殖能力强、生殖周期短、遗传背景稳定、操作系统成熟，因此已经成为先天性心脏病遗传研究的理想模型。

Tbx1是转录因子T-box家族的成员之一。已有研究报道，使用Tbx1基因敲除的小鼠模型，证实了Tbx1是22q11.2微缺失综合征（22q11 deletion syndrome，22q11.2DS）的候选基因。具体来说，Tbx1+/-小鼠中观察到心脏流出道(outflow tract, OFT)表现出轻度缺陷，Tbx1-/-小鼠显示更严重的心脏、颅面、胸腺和甲状旁腺缺陷，相关表型与DiGeorge 综合征（DiGeorge syndrome,DGS）/腭心面综合征(velocardiofacial syndrome,VCFS)患者一致。此外，小鼠基因剂量研究表明，Tbx1属于剂量依赖性基因，其表达在不同组织中的空间和时间都存在差异，胚胎心脏发育过程中Tbx1的表达需要精确调控。值得注意的是，已报道的Tbx1敲除小鼠是对可变剪切体的共同区域敲除，无法准确区分不同可变剪切体在发育过程中的作用及机制。换而言之，目前已经报道的Tbx1基因敲除小鼠虽然能够证明该基因主要功能及其调控网络，但无法区分Tbx1不同可变剪切体在心脏发育过程中的作用及机理。因此，需要一种能够准确区分Tbx1不同剪切体的小鼠模型探究之间的差异，为揭示不同剪切体在致病机制方面提供有效的工具。

与锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases , ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术具有周期短、效率高、特异性强的优点。同时借助V5、3xFlag不同的标签蛋白准确区分Tbx1不同可变剪切的表达形式，通过点突变实现对相应剪切体的缺失，通过Cre-loxp系统可以实现Tbx1 201和Tbx1 203的条件性敲除，相关小鼠的获得为揭示Tbx1不同可变剪切体在心脏发育过程中的作用机制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方法。

本发明提供一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的基因修饰小鼠的制备方法，其特征在于：

设计和构建Tbx1 201和203可变剪切体的靶向载体；

选择Tbx1 201和203一号内含子作为编辑位点；

通过显微注射将靶向载体、guide RNA和Cas9蛋白共同注入小鼠受精卵中。

进一步，本发明的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方法，还具有这样的特征：基因修饰小鼠通过PCR和基因测序方法筛选子代阳性小鼠。