[发明专利]一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的基因修饰小鼠的制备方法

权利要求书

1.一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方法，其特征在于：

设计和构建Tbx1 201和203可变剪切体的靶向载体的步骤；

选择Tbx1 201和203一号内含子作为编辑位点；

通过显微注射将靶向载体、guide RNA和Cas9蛋白共同注入小鼠受精卵中。

2.如权利要求1所述的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方法，其特征在于：

基因修饰小鼠通过PCR和基因测序方法筛选子代阳性小鼠。

3.如权利要求3所述的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方法，其特征在于：

与Tbx1可变剪切体相匹配的guide RNA序列1为：CTTTCGGTCAAG GACTTAGTAGG

与Tbx1可变剪切体相匹配的guide RNA序列2为：CTGGGACTCTTC GAATTCGAGGG。

4.如权利要求1所述的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方法，其特征在于：

胚胎分离和显微注射流程：

1）第一天，选择3~4周龄C57BL/6J雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射5 IU孕马血清促性腺激素(PMSG)，48 h后腹腔注射5 IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)，注射后立刻与2~8月雄鼠交配；

2）第二天，上午9点前检查小鼠阴道栓，将供体雌鼠与雄鼠分离；

3）第四天，从雌鼠输卵管中收集受精卵，卵丘细胞放置于含有0.1%牛透明质酸酶的M2培养基中；释放受精卵，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养；

4）在倒置显微镜下，挑选形态正常，透明带和雄原核清晰的受精卵用于显微注射；

5）用吸持毛细管吸住受精卵，将酶切鉴定正确的靶向载体、guide RNA和Cas9 蛋白共同注射到受精卵的细胞质中；

6）显微注射300~400枚受精卵，将注射后的受精卵在M16（Sigma）培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养1小时；

7）在显微注射前一天准备3~6月龄的代孕雌鼠，腹腔注射120 mg/kg氯胺酮和16 mg/kg甲苯噻嗪麻醉代孕的雌鼠，置于恒温台上；

8）用无菌剪刀剪开小鼠腹腔的皮肤，把代孕雌鼠子宫角拉出，用0.9％NaCl溶液保持湿度，固定好子宫；

9）用镊子夹住输卵管壶腹上端，在输卵管壁形成一个小孔；用细玻璃毛细管注射20~30枚受精卵至每只代孕雌鼠的输卵管中；

10）将子宫重新放入小鼠体内，手术缝合后将小鼠放入饲养笼中饲养；

11）待小鼠出生2~3周后，剪耳编号，剪尾后提取基因组，PCR扩增片段，测序鉴定，获得阳性F0代小鼠；

12）性成熟的阳性F0代小鼠分别与野生型C57BL/6J小鼠交配获得F1代小鼠，出生后2周龄左右的子代小鼠剪尾后提取基因组，用引物序列3和引物序列4进行PCR鉴定。

5.如权利要求4所述的区分Tbx1两种可变剪切体的靶向载体及其基因修饰小鼠的制备方法，其特征在于，还包括：

小鼠基因型的鉴定过程：

1）剪取0.1-0.2 cm的小鼠尾巴于1.5 ml EP管中，加入150 μl NaOH (50mM)裂解缓冲液；

2）保证裂解液没过样品，65℃恒温水浴锅中孵育过夜；

3）12000 rpm离心2分钟，吸取上清；

4）加入20 µl Tris-HCl (1M, PH7.5)，充分混匀；

5）酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的比例加入150 μl混合液，涡旋振荡混匀；

6）12000 rpm离心2分钟，吸取上清至新的EP管中；

7）加入1 ml预冷的无水乙醇，充分混匀，4℃，12000 rpm离心10分钟，弃上清；

8）超净工作台中干燥，用100 μl双蒸水溶解沉淀，取2μl作为模板进行PCR鉴定。