[发明专利]一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法

说明书

本发明公开一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法，属于病毒扩增生物技术领域。为了提高禽腺病毒的培养后的活力。一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法是将I群8型禽腺病毒接种于LMH细胞无血清悬浮细胞系中，利用WAVETM波浪式生物反应器进行培养。该方法可以大量降低生产成本，而且生产周期短、病毒含量高，提高了培养过程中的传氧系数，减少生产耗时，提高了生产效率和疫苗的产量及质量。

技术领域

本发明属于病毒扩增生物技术领域，具体涉及一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法。

背景技术

禽腺病毒(FAdV)广泛存在于鸡群中，主要引起鸡包涵体肝炎(FAdV-8b)、心包积水综合征(FAdV-4)外还引起产蛋下降和肌胃糜烂等症状。该病的特点就是感染率高、病原复杂，常与一些能导致禽类呼吸道疾病相关的病原微生物混合感染或者在免疫抑制时发生疾病，从而造成严重的损失，该病在所有养禽的国家基本上均有发生，对该病的防控已经成为国际禽病研究中的热点问题。

禽腺病毒是一种双股DNA无囊膜病毒，直径70～90nm之间，二十面立体对称结构，实验室分离该病毒主要是接种鸡肝癌上皮细胞(LMH)，目前禽腺病毒的培养主要都采用贴壁的LMH细胞，该传统工艺生产半成品抗原效价低，不仅影响免疫效果而且直接影响疫苗成本及价格，悬浮培养大多采用生物反应器培养，传统的生物反应器在使用前需要对罐体进行清洗、灭菌及验证等工作，增加了生产耗时及污染的可能；而且罐体的搅拌桨在培养过程中对悬浮细胞会产生一定的剪切力，从而产生对细胞的持续性损伤，降低细胞的存活率，影响产毒效率；另外受传统罐体的结构设计影响导致了其传氧效率方面有待提高。

发明内容

本发明的目的是为了提高禽腺病毒的培养后的活力。

本发明提供一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法，所述培养方法是将I群8型禽腺病毒接种于LMH细胞无血清悬浮细胞系中，利用WAVETM波浪式生物反应器进行培养。

进一步地限定，获得LMH细胞无血清悬浮细胞系的方法如下：

步骤1：制备含有3％-8％血清的培养液；

步骤2：将LMH贴壁细胞在含有8％血清的培养液中培养，然后将细胞移植在血清含量梯度降低的培养液中培养；

步骤3：将步骤2中获得的细胞进行消化后放置在无血清全悬浮培养基中培养，获得LMH细胞无血清悬浮细胞系。

进一步地限定，步骤2的步骤如下：将LMH贴壁细胞接种在培养液中按照1:3比例传代，传代3～5代后，将培养液中的血清浓度下降，连续传代5代以上，获得培养后的LMH贴壁细胞，再将血清浓度下降得到低血清培养液，将低血清培养液培养步骤1获得的培养后的LMH贴壁细胞，按照1:4比例传代。

进一步地限定，步骤1中所述将培养液中的血清浓度下降为5％，所述低血清培养液中的血清为3％。

进一步地限定，步骤3的步骤如下：

步骤3.1：选择长满单层的LMH细胞进行消化，将消化后的细胞接种至LMH细胞全悬浮培养基培养，控制细胞的密度为1.5～2.0×10⁶cells/ml；

步骤3.2：重复步骤3.1，保持48h时活细胞密度3.0～4.0×10⁶cells/ml且活率高于90％，即获得LMH细胞无血清悬浮细胞系。

进一步地限定，步骤3.1中控制细胞的密度是在消化后的细胞接种至LMH细胞全悬浮培养基培养48小时的时候。

进一步地限定，步骤3中消化的方法是将长满单层的细胞上清液弃掉，加入2-5mlPBS洗2次，弃掉PBS，加入0.25％的胰酶作用1min后弃掉胰酶，1min后加入准备好的培养基终止消化，将细胞吹匀备用。