[发明专利]一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法

权利要求书

1.一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，所述培养方法是将I群8型禽腺病毒接种于LMH细胞无血清悬浮细胞系中，利用WAVETM波浪式生物反应器进行培养。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，获得LMH细胞无血清悬浮细胞系的方法如下：

步骤1：制备含有3％-8％血清的培养液；

步骤2：将LMH贴壁细胞在含有8％血清的培养液中培养，然后将细胞移植在血清含量梯度降低的培养液中培养；

步骤3：将步骤2中获得的细胞进行消化后放置在无血清全悬浮培养基中培养，获得LMH细胞无血清悬浮细胞系。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤2的步骤如下：将LMH贴壁细胞接种在培养液中按照1:3比例传代，传代3～5代后，将培养液中的血清浓度下降，连续传代5代以上，获得培养后的LMH贴壁细胞，再将血清浓度下降得到低血清培养液，将低血清培养液培养步骤1获得的培养后的LMH贴壁细胞，按照1:4比例传代。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤1中所述将培养液中的血清浓度下降为5％，所述低血清培养液中的血清为3％。

5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤3的步骤如下：

步骤3.1：选择长满单层的细胞进行消化，将消化后的细胞接种至LMH细胞全悬浮培养基培养，控制细胞的密度为1.5～2.0×10⁶cells/ml；

步骤3.2：重复步骤3.1，保持48h时活细胞密度3.0～4.0×10⁶cells/ml且活率高于90％，即获得LMH细胞无血清悬浮细胞系。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤3.1中控制细胞的密度是在消化后的细胞接种至LMH细胞全悬浮培养基培养48小时的时候。

7.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤3中消化的方法是将长满单层的细胞上清液弃掉，加入2-5mlPBS洗2次，弃掉PBS，加入0.25％的胰酶作用1min后弃掉胰酶，1min后加入准备好的培养基终止消化，将细胞吹匀备用。

8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，利用WAVETM波浪式生物反应器进行培养的方法如下：

步骤1：将LMH细胞无血清悬浮细胞以1.5～2.0×10⁶cells/ml初始细胞密度接种于500ml摇瓶中，置于37℃、5％CO₂、转速为100rpm的振荡培养箱中培养48～72小时；

步骤2：将步骤1获得的LMH细胞无血清悬浮细胞接种于2L的细胞培养袋，工作体积为1L，初始接种密度为1.0～1.5×10⁶cells/ml，控制WAVETM波浪式生物反应器的反应条件，细胞密度达到3～4×10⁶cells/ml，控制细胞活力在90％以上，则该细胞可以用于接毒试验；

步骤3：通过补料泵将I群8型禽腺病毒输入步骤2中的细胞培养袋中，接毒量为1‰，待细胞活率降至50％～60％收获病毒液，收获I群8型禽腺病毒；

步骤4：取LMH全悬浮细胞，导入10L的灌注用细胞培养袋，工作体积为5L，初始细胞密度1.0～1.5×10⁶cells/ml，控制WAVETM波浪式生物反应器的反应条件，当细胞密度增长至3～4×10⁶cells/ml时，接种步骤3获得的I群8型禽腺病毒，接毒量为1‰，待细胞活率降至45％～55％收获病毒液，收获I群8型禽腺病毒；

步骤5：取LMH全悬浮细胞，导入50L的灌注用细胞培养袋，工作体积为25L，初始细胞密度1.0～1.5×10⁶cells/ml，控制WAVETM波浪式生物反应器的反应条件，当细胞密度增长至3～4×10⁶cells/ml时接种步骤4获得的I群8型禽腺病毒，接毒量为1‰，待细胞活率降至45％～55％收获病毒液，收获I群8型禽腺病毒。