[发明专利]一种脯氨酸保护型抗酶解抗菌肽及其制备方法和应用

说明书

本发明公开一种脯氨酸保护型抗酶解抗菌肽及其制备方法和应用，属于生物技术领域，其序列为SEQ ID No.1所示，将简约化原则和氨基酸合理排布规避蛋白酶酶切位点多肽设计策略相结合，设计出具有高抗菌活性、低毒性和高稳定性的的抗酶解肽。经测试，抗酶解抗菌肽WPRP5对所测试的绝大部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，平均抗菌活性达到2.83μM。同时其溶血活性和细胞毒性较低，细胞选择性指数高达70.9；除此之外，抗酶解肽WPRP5在人工模拟肠液、人工模拟胃液和10mg/mL糜蛋白酶溶液中依旧保持了较高的抗菌活性；因此，本发明的抗酶解抗菌肽WPRP5是一种具有较高临床应用价值的抗酶解抗菌肽。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脯氨酸保护型抗酶解抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

抗生素滥用引起的耐药性问题已经成为全球最大的危机之一。与人类用药不同，饲用抗生素监管力度不严，滥用现象普遍，动物体内抗生素残留量严重超标，动物生产力下降等问题都制约着畜牧业的发展。因此开发新型、绿色的饲用抗生素替代技术，无疑具有重大的现实意义。抗菌肽是动植物机体抵御外界微生物侵害及清除体内突变细胞的一类小分子多肽，具有抗菌谱广，种类多和不易产生抗性突变等诸多优点。因此其被认为是抗生素最有力的替代者。然而天然抗菌肽仍然存在着效价不足、对哺乳动物细胞毒性高、盐离子和蛋白酶环境中稳定性差等诸多劣势。而作为饲料添加剂，蛋白酶稳定性差和生产成本高无疑是阻碍其进一步推广应用的最大障碍。因此，通过药物设计开发全新的人工合成肽，是解决抗菌肽应用瓶颈的最佳途径。

为了解决这些难题，环化、类肽、D型氨基酸嵌入等共价键修饰策略被用于提高人工合成肽的蛋白酶耐受力，然而这些策略在提高多肽蛋白酶抗性的同时也大幅度增加了其合成难度，且这些肽不能通过原核或真核表达系统进行低成本产业化生产。与利用共价键修饰规避蛋白酶酶切位点的化学合成策略不同，通过天然氨基酸合理排布规避蛋白酶酶切位点同样可以达到提高多肽蛋白酶抗性的目的。蛋白酶的酶切位点不尽相同，但是这些特异性酶切位点都会受到氨基酸排布的影响。例如，胰蛋白酶优先切割P1位置的Arg和Lys，且对Arg的特异性更高。当Pro处于P1'位置时可阻碍胰蛋白酶对Arg和Lys的切割作用，但是当Lys处于P1位置并且Trp处于P2位置时，P1'位置的Pro并不能阻碍胰蛋酶对P1位Lys的切割作用。同样地，Pro在P1'位，Arg在P1位，Met在P2位也不会阻碍胰蛋白酶的切割作用。除上述情况之外，以下情况同样可以阻断胰蛋白酶对P1位Lys的切割活性：Asp同时处于P2位和P1'位；Cys在P2位且Asp在P1'位；His在P1'位；Cys在P2位并且Tyr位于P1'位。对于Arg处于P1位时，可以降低胰蛋白酶对其切割效率的氨基酸位置排布如下：Arg在P2位且His在P1'位；Cys在P2位且Lys在P1'位；Arg同时处于P2位和P1'位。糜蛋白酶对芳香族氨基酸具有高度特异性。但Met或Pro处于P1'位置时会阻止糜蛋白酶对P1位置Trp的水解作用。此外，P1'位置的Pro同样可以阻断糜蛋白酶对P1位置Tyr和Phe的酶切。这些规则在天然肽修饰过程中如合理的应用，可以很好的增强天然肽的蛋白酶抵抗力。然而根据先前的研究发现，该策略的有效性高度依赖氨基酸在序列中的精确定位，且提高多肽蛋白酶抗性的同时很可能破坏了原肽的结构参数平衡，降低了原肽的活性，增加其细胞毒性，从而严重限制了其适用性。

发明内容

基于以上背景技术的问题，本发明的目的在于提供一种脯氨酸保护型抗酶解抗菌肽WPRP5，将简约化原则和氨基酸合理排布规避蛋白酶酶切位点多肽设计策略相结合，设计出具有高抗菌活性、低毒性和高稳定性的的抗酶解肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，分子式如式(I)所示：

本发明的另一目是提供一种脯氨酸保护型抗酶解抗菌肽WPRP5的制备方法，步骤如下：