[发明专利]用于检测I型和II型非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR引物探针组、方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测I型和II型非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR引物探针组、方法及应用，所述荧光PCR引物探针组包括如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示的引物对，如SEQIDNo:3所示的第一特异性探针，以及如SEQIDNo:4所示的第二特异性探针。本发明提供的多重荧光PCR引物探针组、试剂盒和检测方法解决了现有技术中ASFVI型和II型的鉴别性检测的成本较高，灵敏度不够，检测方法复杂等问题，实现了灵敏度高，能准确地对ASFVI型和II型毒株进行鉴别，特异性强的效果。

技术领域

本发明涉及动物病原分子诊断技术领域，具体地，涉及用于检测I型和 II型非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR引物探针组、试剂盒、方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)引起的一种以高发病率和高死亡率为特征的急性接触性传染病。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。急性型ASF临床表现为高热、皮肤发绀和各脏器出血，病死率高达100％，对养猪业危害巨大，严重冲击生猪产业的国际贸易。目前尚无有效控制该病的疫苗和治疗药物，主要通过检测结合扑杀控制该病的传播。

前期序列分析结果显示，我国首例ASFV分离株为基因II型。后续我们进一步在基因组层面进行进化分析，结果显示，目前全球ASFV分离株可划分为3个进化谱系(Lineage)，中国分离株属于谱系I、基因II型(基于p72 基因的分型系统)。所有的亚洲分离株均属于谱系I和基因II型，所有的欧洲毒株也属于谱系I，但是具有两个基因型(基因I型和II型)。在进化关系上亚洲分离株与部分欧洲分离株混杂在一起，提示其可能具有共同的来源。非洲存在多个基因型，这可能因为非洲地区存在家猪-野猪、野猪-野猪、野猪-软蜱、软蜱-家猪及野猪-软蜱-野猪等多种传播循环，进而导致病毒在不同宿主之间的传播和基因组的变异。

因此，建立一种新的针对非洲猪瘟病毒I型和II型中国流行毒株鉴别方法，使其能够实现对目前流行的ASFVI型和II型毒株进行可靠的鉴别检测是本发明亟需解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于针对现有技术中ASFVI型和II 型的鉴别性检测的成本较高，灵敏度不够，检测方法复杂等问题，从而提供一种灵敏度高，能准确地对ASFVI型和II型毒株进行鉴别，特异性强的用于检测I型和II型非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR引物探针组、试剂盒和检测方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于检测I型和II型非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR引物探针组，所述荧光PCR引物探针组包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对，如SEQ ID No:3所示的第一特异性探针，以及如SEQ ID No:4所示的第二特异性探针。

优选地，所述第一特异性探针和所述第二特异性探针的5’端各自标记有荧光报告基团；

所述第一特异性探针和所述第二特异性探针的3’端各自标记有小沟结合物和非荧光猝灭基团；且，

所述荧光报告基团选自VIC和/或FAM。

本发明还提供了一种用于检测I型和II型非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR 试剂盒，所述多重荧光PCR试剂盒包括如上述所述的多重荧光PCR引物探针组和DNA酶混合液。

优选地，所述DNA酶混合液包括酶稀释液、热启动Taq酶和脱氧核糖核苷酸。

优选地，所述脱氧核糖核苷酸选自dATP、dUTP、dGTP以及dCTP中的一种或多种。

优选地，所述引物对、所述第一特异性探针和所述第二特异性探针的浓度各自为0.1-1.5μmol/L。

本发明还提供了一种用于I型和II型非洲猪瘟病毒的检测方法，采用根据上述所述的多重荧光PCR试剂盒。