[发明专利]细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法

说明书

细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，包括：S1.将固定于Matrigel中的PDLO消化下来，添加培养基制备成PDLO悬液并计数；S2.悬浮培养PDLO悬液，以修复消化下来的PDLO；S3.将单克隆菌落培养制备为定量细菌悬液；S4.将定量细菌悬液加入PDLO悬液中，建立细菌感染肺类器官模型；以及S5.提取原代PBMC计数后加入细菌感染肺类器官模型中，以构建细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系。本方法构建了多细胞种类的PDLO并与常见致病菌及外周血单个核细胞共培养，能够显著提高PDLO细菌感染肺类器官模型与免疫微环境混合共存体系的构建效率，有效且稳定地模拟人体肺部感染后的机体抗感染反应及免疫反馈的过程。

技术领域

本发明涉及细胞感染技术领域，尤其涉及一种细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法。

背景技术

“类器官(Organoid)”一词早在1946年便被用来描述肿瘤的某些组织学特征^[1]。然而，直到2009年肠类器官的发展^[2]，它才开始专用于描述自组织的体外结构。类器官可用于模拟人体器官发育和各种疾病的病理变化^[3]，而患者来源的类器官(Patient-derivedOrganoid,PDO)则可以进行广泛的分子诊断和药物筛选，有望以个体化的方式预测机体对药物反应。目前，对于PDO的研究主要应用于各类肿瘤的免疫调节方面，在感染性疾病免疫调节中的应用很少。

在COVID-19的疾病进程中，患者的自身免疫功能也同时影响着病情变化。疾病早期患者仅表现为病毒性感染的一般症状，如果患者的免疫系统过度激活、炎症因子急剧增加，形成炎症因子风暴后，死亡率由轻型或普通型的＜4％显著增长至重型或危重型的＞50％^[5-8]。因此，病程早期进行免疫调节治疗对降低重症转化率和死亡率有重要意义^[9,10]。不仅针对病毒性感染，全身免疫功能失调是多种病原体感染性疾病的病理生理基础的基本分子机制，可以导致严重的脓毒症和败血症性休克^[11]。免疫系统在炎症性疾病中发挥的重要作用也备受关注。

肺类器官(Lung organoid)主要由两种来源的细胞构建而成：从成熟肺组织分离的上皮干/祖细胞^[12]和人类多能干细胞^[13-15]，前者来源的肺类器官称之为患者来源肺类器官(Patient-derived Lung Organoid,PDLO)，主要包括基底祖细胞、气道分泌细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial type 2,AT2 cells) 等。建立PDLO有助于进一步了解人类肺部的发育过程和肺部疾病的病理生物学，这两点都是寻找治疗呼吸系统疾病新方法的关键。目前为止，人类肺部发育、修复和再生的几个重要研究结果都是从小鼠模型中推断出来的^[16]。然而，人与鼠的肺组织之间存在着许多内在差异，如基底细胞遍布于人体气道，但在小鼠中仅限于气管，亦如杯状细胞在人呼吸道中常见，但在小鼠中少见等。虽然肺上皮细胞系能够表现出人类肺组织的一些表性特征，但这些细胞系只能单层培养，并且很难通过其进一步了解肺组织发育和形成过程的影响因素，如上皮-间充质相互作用和分支形态发生等^[17]。因此，建立能够还原人体环境的体外模型是准确研究人肺发育和疾病病程的关键。