[发明专利]一种靶向脊髓前角运动神经元AMPK的AMAN小鼠模型构建方法

权利要求书

1.一种靶向性敲低脊髓前角运动神经元AMPK的AMAN小鼠模型构建方法，其特征在于，包括：

构建GD3s KO小鼠；

制备靶向性敲除小鼠AMPK表达的腺相关病毒AAV2/2Rretro-AMPK knockdown；

将所述腺相关病毒AAV2/2Rretro-AMPK knockdown注射至所述GD3s KO小鼠中，得到所述小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建GD3s KO小鼠的方法包括：

通过同源重组替换GD3s基因的靶基因，插入到载体中，构建重组打靶载体；

将所述打靶载体电转至ES细胞中，得到电转ES细胞；

将所述电转ES细胞注入小鼠囊胚，再移植至母鼠子宫中，将分娩获得的雄性小鼠与野生型雌性小鼠交配获得嵌合小鼠F0代，F0代杂合子小鼠交配，得到的F1代纯合子小鼠即为所述GD3s KO小鼠。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述靶基因序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组步骤包括：从BAC克隆子RP23-18C16和RP23-378B8中套取得到左右同源臂，将所述同源臂和正筛选标记基因Neo通过酶切连接的方式插入至载体中。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述腺相关病毒AAV2/2Rretro-AMPKknockdown的制备方法包括：将靶向性敲低AMPK的腺相关病毒载体与辅助质粒pAAV-RC、腺病毒Helper质粒共同转染T细胞，培养后离心收集细胞沉淀，经裂解、纯化得到所述腺相关病毒。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述靶向性敲低AMPK腺相关病毒载体的制备方法包括：基因合成AMPK的Prkaa1亚基、Prkaa2亚基，利用同源重组插入到骨架载体上；所述Prkaa1亚基miRNAi的靶序列如SEQ ID No.12所示，所述Prkaa2亚基miRNAi的靶序列如SEQ ID No.13所示；所述载体骨架为pAAV2-Hb9-eGFP-Cre-EGFP-WPRE-pA。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述腺相关病毒的病毒滴度为5.0E+12～5.0E+13。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述注射部位为双侧胫骨前肌，每侧剂量为2～5μL；所述注射的角度为15～45°。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述注射12～15d后还包括：暴露所述GD3s KO小鼠的双侧坐骨神经，挤压至透明后，腹腔注射抗GD1a IgG抗体；所述抗GD1a IgG抗体的注射剂量为1～3mg。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述挤压时间为25～35s；每隔1～3天注射抗GD1a IgG抗体一次，注射5～8次。