[发明专利]SortaseA酶作为蛋白水解酶在蛋白纯化领域中的应用

说明书

本发明公开了SortaseA酶作为蛋白水解酶在蛋白纯化领域中的应用，涉及蛋白质工程技术领域，SortaseA酶作为蛋白水解酶的反应条件为：50mMTris‑HCl，pH7.5，500mMNaCl,5％glycerol,5mMDTT,0.1MTrehalose，1mMEDTA,5mMGlycine,1mMCaClsubgt;2/subgt;。本发明提供了一种利用SortaseA酶水解酶活性作为一种新的蛋白水解酶在蛋白纯化过程中融合标签切除的应用。通过优化SortaseA酶的反应条件，增强其水解酶活性，从而使其作为一种新的蛋白水解酶，SortaseA与常用的TEV酶相比具有产量高、热稳定性高且酶切效率更高等特点且经Sortase酶酶切后的产物可以实现任一标记修饰如生物素标记、荧光标记等。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及SortaseA酶作为蛋白水解酶在蛋白纯化领域中的应用。

背景技术

转肽酶SortaseA是从金黄色葡萄球菌中分离得到的，该酶可以特异性识别并结合蛋白质C端的LPXTG序列，切断苏氨酸和甘氨酸之间的肽键，与苏氨酸的羧酸形成硫酯中间体，该中间体容易被其他N末端含有甘氨酸残基底物进行亲和取代，从而蛋白的C端与该底物进行相连，起到蛋白连接以及修饰的功能。同时，其水解酶的活性大幅度降低。

到目前为止，SortaseA的修饰功能已经广泛被应用，包括生物素修饰、荧光修饰以及化学基团修饰等等。然而，其水解活性是否与一些其他蛋白水解酶如TEV酶同样可以应用于蛋白纯化过程中标签的切除还未有报道。

基于上述内容，提出SortaseA酶作为蛋白水解酶在蛋白纯化领域中的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了SortaseA酶作为蛋白水解酶在蛋白纯化领域中的应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了SortaseA酶作为蛋白水解酶在蛋白纯化领域中的应用。

进一步改进在于，SortaseA酶作为蛋白水解酶的反应条件为：50mM Tris-HCl，pH7.5，500mM NaCl,5％glycerol,5mM DTT,0.1M Trehalose，1mM EDTA,5mM Glycine,1mMCaCl2。

进一步改进在于，所述SortaseA酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步改进在于，编码所述SortaseA酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步改进在于，表达所述SortaseA酶的载体为pET-28a,表达菌株为大肠杆菌BL21。

进一步改进在于，所述SortaseA酶识别的目的蛋白序列中包含特定的SortaseA识别序列：LPETGGH。

本发明还提供了一种在目的蛋白上实现修饰标记的方法，利用上述作为蛋白水解酶的SortaseA酶水解目的蛋白，获得的酶切后的产物，对酶切后的产物进行分子标记修饰。

进一步改进在于，所述分子标记修饰为生物素修饰、荧光修饰或化学基团修饰。

本发明具有如下有益效果：

1.本发明提供了一种通过优化反应条件大幅度提高SortaseA酶水解酶活性，实现其作为一种新的蛋白水解酶的在蛋白纯化领域中的应用；

2.本发明提供了SortaseA酶作为一种新的蛋白水解酶的应用，在作为水解酶应用时只需在目标蛋白的序列中添加LPETGGH序列即可实现对任意融合标签蛋白标签的去除；

3.本发明提供的蛋白水解酶SortaseA酶与常规的TEV酶相比具有更高的Tm值，暗示着SortaseA酶稳定性更高，具有更广泛的应用场景；