[发明专利]一种漆酶EcLac及其应用、以及漆酶基因eclac及其应用

说明书

本发明公开一种漆酶EcLac及其应用、以及漆酶基因eclac及其应用；所述漆酶EcLac的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述。与原始的漆酶Lac相比较，漆酶EcLac的活性提高约3.9倍，使得所述漆酶EcLac具有高产、高活性的优点，且制造成本低，适于工业化生产，解决了现有漆酶的产量过低、活性较低、成本较高的问题。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种漆酶EcLac及其应用、以及漆酶基因eclac及其应用。

背景技术

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶。生漆在东方是一种历史悠久的自然资源。1883年Yoshida首次发现促进生漆凝固的主要成分是一种特定的蛋白质。1894年Bertrand再次确证了这种功能蛋白质是成漆的关键酶类，并正式命名为漆酶；此后，人们逐渐对漆酶的特性进行深入研究并开发漆酶的应用潜力，至今已有一百三十多年历史；漆酶可以通过获得O₂来催化多酚、多氨基苯等物质的氧化；统计发现它可以催化氧化大约三百余种不同类型的底物；在难降解化合物的降解、纸张脱色、洗涤、霉菌毒素降解等一系列行业中都具有巨大的应用潜力。

漆酶分布广泛，依照来源可分为植物漆酶、昆虫漆酶、真菌漆酶以及细菌漆酶；一直以来人们致力于研究真菌漆酶，但随着对漆酶需求的日益增加，真菌漆酶产量低、成本高等缺点导致其已难以满足现代工业化产业需求；细菌漆酶相较于其他漆酶具有来源广、生长周期短、热稳定性好、pH范围宽等优势受人们重视；细菌漆酶属于含铜蛋白，漆酶分子有三个结构域，每个结构域之间有loop连接；细菌漆酶含有4个保守的铜原子区域，构成细菌漆酶分子的活性中心；大肠杆菌(Escherichia coli)漆酶存在于大肠杆菌的周质空间，其结构具有细菌漆酶典型的保守活性中心，因此被认为是细菌漆酶家族的一员。

已有部分文献对细菌漆酶进行过相关报道，但针对大肠杆菌漆酶结构域对功能的影响，漆酶在食品安全和对霉菌毒素降解等方面的研究却未见报道；虽然已有针对细菌漆酶结构差异的研究报道，但目前，漆酶的工业化应用仍然存在需要解决的关键性问题：1)酶来源受限；2)自然条件下，酶的活性较低；3)产量较低，经济成本较高。

如上所述的不足之处已严重制约了漆酶在工业上的应用进程，特别是在食品加工与食品安全领域，对霉菌毒素的降解需要高效的漆酶。自然条件下，漆酶的活性和产出量有限，利用常规选育方法很难满足工业化生产的需要。因此，利用基因工程技术，对漆酶进行必要的分子改造，这样不仅能有效提高重组表达体分泌外源蛋白的能力，还能理性、有针对性地改造提高漆酶的活力和降解效率；与传统方法相比，精准而高效地赋予酶新的特性，从而更好地满足工业化生产的需要。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种漆酶EcLac及其应用、以及漆酶基因eclac及其应用，旨在解决现有漆酶的产量过低、活性较低、成本较高的问题。

为实现上述目的，本发明提出的一种漆酶EcLac，所述漆酶EcLac的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提出了一种漆酶基因eclac，所述漆酶基因eclac用于编码如上述的漆酶EcLac，所述漆酶基因eclac的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，或者，所述漆酶基因eclac的碱基序列与SEQ ID NO：2所示的碱基序列具有95％以上的同一性。

本发明还提出了一种重组表达载体，包括如上述的漆酶基因eclac。

本发明还提出了一种重组表达载体的制备方法，包括以下制备步骤：

将漆酶基因eclac的两端引入酶切位点EcoR I和Not I，通过限制性内切酶酶EcoRI和Not I双酶切，获得漆酶基因EcLac片段；

将毕赤酵母表达载体pPICZA分别用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，获得载体pPICZαA片段；