[发明专利]一种sgRNA及培育Fel d1 CH2基因定点突变猫的方法和应用

说明书

本发明涉及到一种基于CRISPR‑Cas9基因编辑技术的sgRNA序列选择，基因定点突变制备低过敏源猫的方法，具体的说是针对猫Fel d1 CH2基因第二外显子序列设计特异性sgRNA序列，将sgRNA和Cas9蛋白复合物电转染入猫原核期胚胎中定点突变Fel d1 CH2基因，改变表达的Fel d1蛋白抗原性，用于生产、培育低过敏源的猫,培育低致敏原猫可改善室内的过敏源，降低对猫过敏的人的过敏反应，有利于宠物主人的健康，尤其是对猫严重过敏的爱猫人士来说，饲养猫成为可能。基于CRISPR‑Cas9技术猫基因编辑技术平台的建立，有利于开展与人疾病相关的其他猫科动物模型的建立与应用，推动猫科动物疾病模型的发展，为科学家提供一种新的实验动物模型，促进猫科动物转基因抗病育种的发展。

技术领域

本发明属于生命科学和动物遗传育种领域，涉及到一种基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的sgRNA序列选择及猫基因定点编辑制备低过敏源猫的方法，具体的说是针对猫Feld1 CH2基因第二外显子序列设计特异性sgRNA，将sgRNA和Cas9蛋白复合物电转染入胚胎中以定点突变Fel d1 CH2基因，用于生产、培育低过敏源的猫。

背景技术

猫过敏源是室内吸入性过敏原的重要来源，参与IgE介导的过敏反应。Fel d1作为猫过敏源中最主要的致敏源，是由猫的皮脂、肛门腺和唾液腺分泌并存在于猫的皮肤，常引起过敏性病人的过敏性疾病如鼻炎和哮喘等呼吸道疾病。随着经济发展和人们生活水平的提高，宠物猫在全球范围内的饲养比例逐渐上升。猫也是室内环境中过敏源的主要来源，其在过敏性呼吸道疾病中发病率仅次于尘螨，高居于第二位。普通人群中对猫过敏的比率逐年上升，可达到10-30％。其引起的呼吸道症状严重程度不一，从普通鼻炎到哮喘，乃至严重哮喘，最严重可发展至危及生命的发病情况。因此，培育低致敏源猫可改善室内的过敏源，降低对猫过敏的人的过敏反应，有利于宠物主人的健康，尤其是对猫严重过敏的爱猫人士来说，饲养猫成为可能。但传统的利用免疫治疗的方法或饲喂含Igγ抗体的食物达到拮抗猫体内Fel d1蛋白，以获得低致敏原的猫，但效果仍不是很理想。利用基因编辑技术敲除Fel d1基因可从源头上阻止过敏蛋白的产生可能是获得低致敏源猫最有效的方法。

Fel d1是一种大小约为35-40kDa的分泌性球蛋白，其具体生物学功能仍不明确。Fel d1蛋白由2个18-20kDa的异二聚体组成，每个二聚体分别由CH1和CH2基因编码成的CH1和CH2多肽链组成，如果能利用基因编辑技术突变CH1和CH2基因改变Fel d1蛋白结构和抗原位点，因而可能降低猫过敏源的产生，从而可获得低致敏原猫，利用该类型的猫为疾病模型有利于研究Fel d1基因的功能，为人类过敏疾病的发病机制等研究提供理论基础。

猫基因组编辑技术发展滞后，至今没有获得具有疾病表型猫的文献报道。因此，基于猫的人类疾病动物模型发展缓慢，培育抗病育种猫极其困难。随着动物基因编辑技术的发展，基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术可以实现高效的基因敲除、敲入、精确的点编辑以及单碱基编辑，先后获得了基因编辑的小鼠、大鼠和家畜等多种动物，这为猫的基因编辑带来了希望，有望实现猫科动物基因编辑技术的突破。

狗或小鼠等的基因组染色体已经重新排列，与人类截然不同，但家猫基因的规模与人类差不多，而且像人类一样，其基因组是非常有组织和保守的。研究灵长类动物成本相对较大，但猫所具有的承受力和温顺天性等特点，使它们成为研究人类基因组可靠的模式动物。因此，猫是一种非常理想的动物模型。基于CRISPR-Cas9技术猫基因编辑技术平台的建立，有利于开展与人疾病相关的其他猫科动物模型的建立与应用，推动猫科动物疾病模型的发展，为科学家提供一种新的实验动物模型种类，促进猫科动物转基因抗病育种的发展。

发明内容