[发明专利]一种sgRNA及培育Fel d1 CH2基因定点突变猫的方法和应用

权利要求书

1.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为sgRNA1或sgRNA2，所述sgRNA1的序列如SEQ IDNO.1所示，所述sgRNA2的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种如权利要求1所述的sgRNA的构建方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：

1)确定猫Fel d1 CH2基因第二外显子的打靶位点序列；

2)针对所述打靶位点序列设计特异性sgRNA序列、正向引物扩增序列；

3)运用正向引物进行PCR扩增并回收PCR产物；

4)以PCR产物为模板利用体外转录试剂盒进行体外转录、纯化，即得到特异性sgRNA。

3.根据权利要求2所述的sgRNA的构建方法，其特征在于，所述猫Fel d1 CH2基因靶位点序列为权利要求1中sgRNA1或sgRNA2。

4.根据权利要求2所述的sgRNA的构建方法，其特征在于，所述正向引物扩增序列为sgRNA1F或sgRNA2F，所述sgRNA1F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述sgRNA2F的序列如SEQ IDNO.4所示。

5.一种培育Fel d1 CH2基因定点突变的低过敏源猫的方法，其特征在于，包括：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除猫Fel d1 CH2一个或多个外显子序列的部分序列，得到Feld1基因定点突变的猫，从而获得低过敏源猫。

6.根据权利要求5所述的培育Fel d1 CH2基因定点突变的低过敏源猫的方法，其特征在于，具体步骤如下：

a)设计并体外转录和纯化猫Fel d1 CH2基因靶位点的特异性sgRNA序列；

b)将所述的特异性sgRNA与Cas 9蛋白混匀，形成蛋白复合体RNP；

c)将RNP电转染入猫胚胎中，短暂培养后移入到同步发情的受体母猫中发育获得出生小猫，通过检测出生小猫基因组靶位点基因突变情况，确定低过敏源猫；

其中，所述猫Fel d1 CH2基因靶位点的位置在第二外显子序列中，所述特异性sgRNA为权利要求1中的sgRNA1或sgRNA2设计得到。

7.根据权利要求6所述的培育Fel d1 CH2基因定点突变的低过敏源猫的方法，其特征在于，步骤a)中所述猫Fel d1 CH2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.利用权利要求5-7任一一项培育Fel d1 CH2基因定点突变的低过敏源猫的方法得到的低过敏源猫育种用或动物模型用于开展与人疾病相关的其他猫科动物模型的应用。