[发明专利]一种巨噬细胞膜包被的仿生DNA纳米药物及其制备方法和应用

权利要求书

1. 一种巨噬细胞膜包被的仿生DNA纳米药物，其特征在于：包括载药DNA纳米笼、胆固醇修饰的TNF-α siRNA和巨噬细胞膜，其中载药DNA纳米笼被巨噬细胞膜包被，胆固醇修饰的TNF-α siRNA插入在巨噬细胞膜的表面。

2. 根据权利要求1所述的仿生DNA纳米药物，其特征在于：所述载药DNA纳米笼为在自组装DNA纳米笼上结合NF-κB诱饵寡脱氧核糖核苷酸（NF-κB decoy dODNs），其中NF-κBdecoy dODNs的正义链核苷酸序列如SEQ ID No.1所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；TNF-α siRNA的正义链核苷酸序列如SEQ ID No.3所示、反义链核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，其8、10、12、14、16、18、20、22、24、25和26位的核苷酸核糖基团的2’位进行甲基化修饰。

3. 根据权利要求2所述的仿生DNA纳米药物，其特征在于：所述巨噬细胞膜源自RAW264.7巨噬细胞。

4.权利要求1-3任一项所述的仿生DNA纳米药物在制备联合抗类风湿性关节炎的药物中的应用。

5.权利要求3所述的仿生DNA纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）培养并收集RAW 264.7巨噬细胞，用Tris-MgCl₂缓冲液重悬后，离心、破碎，再采用差速离心法提取巨噬细胞膜，经PBS溶液重悬后，通过多孔聚碳酸酯膜经物理挤出形成巨噬细胞膜囊泡；

（2）分别将8条短链、5条长链溶于超纯水中，然后加入10×TAMg缓冲液，经超纯水定容后经PCR程序自组装制备DNA纳米笼；

（3）将步骤（2）中8条短链的其中4条的末端通过8个胸腺嘧啶的延长链连接NF-κBdecoy dODNs的其中一条链，再通过碱基互补配对使NF-κB decoy dODNs的互补链连接在短链的末端，制备Cage-dODN；

（4）配制胆固醇修饰的TNF-α siRNA的无菌水溶液，然后与步骤（2）的巨噬细胞膜囊泡涡旋混匀，冰浴超声，再恒温混匀孵育，制得siRNA@M；

（5）将步骤（4）的siRNA@M与步骤（3）的Cage-dODN混合，在冰浴条件下超声处理，获得仿生DNA纳米药物即siRNA@M(Cage-dODN)。

6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中经Tris-MgCl₂缓冲液重悬后RAW 264.7巨噬细胞的浓度为2-3×10⁷个/mL。

7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中依次通过膜孔直径为1 µm、400 nm、200 nm的多孔聚碳酸酯膜。

8. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中8条短链的核苷酸序列如SEQ ID No.5- SEQ ID No.12所示；5条长链的核苷酸序列如SEQ ID No.13- SEQ IDNo.17所示；每条短链的物质的量为200 pmol、每条长链的物质的量为100 pmol；10×TAMg缓冲液的体积为10 μL；定容后的体积为100 μL。

9. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中胆固醇修饰的TNF-αsiRNA的无菌水溶液的终浓度为20 µM，冰浴超声3 min，4 ℃恒温混匀5 min。

10. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中siRNA@M与Cage-dODN的质量比为20:1，其中siRNA的终浓度为100 nM、dODN的终浓度为1 µM；超声处理的参数为42 KHz/100 W/5 min。