[发明专利]一种用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂及检测方法，属于水产品质量安全领域。本发明以恩诺沙星‑D3和恩诺沙星‑D5合并使用作为内标试剂，样品中加入不同浓度的恩诺沙星‑D3和恩诺沙星‑D5内标，只经过一步提取过程，或对样品进行直接稀释，获得两份样品定量溶液，与含有恩诺沙星‑D3和恩诺沙星‑D5的标准溶液曲线同时上机检测，根据样品中恩诺沙星的大致含量，选择合适的校正曲线，通过与两组不同内标浓度的标准溶液曲线进行定量，并且不需要再重新进样，直接对样品进行定量，同时保证了定量结果的准确性，免去了重新进行样品前处理和上机检测的过程。

技术领域

本发明属于水产品质量安全领域，特别涉及一种用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂及检测方法。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin)又名乙基环丙沙星、恩氟沙星，是人工合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，为畜禽和水产用喹诺酮类抗菌药物，是一种微黄色或淡黄色结晶性粉末，味苦，不溶于水，易溶于氢氧化钠溶液、甲醇及氰甲烷等有机溶剂。

恩诺沙星在动物体内半衰期长，有良好组织分布性，在动物体内的代谢主要是脱去乙基而成为环丙沙星，具有抑菌范围广、吸收快、药物在体内存留时间长、药效好的优点，对于革兰氏阳性菌、阴性菌及霉形体具有抑菌作用。对由耐药性致病菌引起的严重感染有效，与其它抗菌素无交叉耐药性。该药对水生动物几乎所有病原菌的抗菌活性均较强，现已被国家指定为动物专用药，在家禽、水产养殖等方面广泛使用。

但长期以及不科学用药导致药物残留超标和细菌的耐药性增强，恩诺沙残留会对中枢神经系统造成不良反应，有潜在的致癌性和遗传毒性，其代谢产物环丙沙星对人体危害较大，因此引起了人们的关注。我国最新版食品安全国家标准GB31650-2019中做了最大残留限量要求。准确、便捷、稳定的检测方法是保证食品质量安全的技术保障，因此，食品中恩诺沙星药物残留检测方法开发研究具有重要意义。

目前，关于恩诺沙星残留常用的检测分析方法主要有高效液相色谱法、化学发光免疫法、分子印迹技术毛细管电泳法等，其中，采用稳定同位素内标试剂的色谱-质谱串联技术具有较高的准确性和灵敏性，越来越多地被应用在食品安全检测领域。

以氘标记化合物为内标试剂的液质联用方法具有较高的准确度和灵敏度，在基于同位素内标试剂的液质法恩诺沙星检测的标准中，目前最常使用的内标为恩诺沙星-D5内标，其结构如下图：

目前主要使用的恩诺沙星检测标准为农业部1077号公告-1-2008水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱—串联质谱法。该标准前处理方法中，提取较为简易、快速，包括提取、除水、旋蒸浓缩、复溶以及去脂等步骤，以液相色谱串联质谱方法进行检测，通过恩诺沙星-D5内标进行定量。以内标法进行定量具有消除前处理过程中操作误差导致的损失、以及液质连用仪器检测过程中由于进样量的误差、仪器响应性能的变化、基质效应的影响等问题带来的系统稳定性差异，从而保证了方法的良好稳定性。并且，由于前处理过程产生的过多的目标化合物损失，以及仪器灵敏度的变化在内标化合物的信号上都可以进行可靠地质控保证，因而对方法使用者具有很好的规避方法整体误差的作用。

工业上合成恩诺沙星的方法主要是环丙沙星与烃化剂(硫酸二乙酯)反应或由1-环丙基-6-氟-7-氯-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸与乙基哌嗪反应制得，其内标恩诺沙星-D5合成方法较复杂，原料不易获取，且成本高。

然而，由于使用的是内标法进行定量，为了使得内标与分析物之间在前处理过程以及仪器响应信号上具有同步性，分析物与内标之间的浓度不宜差异过大，其含量差异比例一般控制在0.1-50之间，以保证方法的可靠性。