[发明专利]一种君迁子带芽茎段获得再生植株的方法

说明书

本发明提供了一种君迁子带芽茎段获得再生植株的方法。包括带芽茎段消毒、丛生芽诱导、愈伤组织诱导、不定芽诱导、生根培养等过程。本发明具有萌发率高，繁殖速率快,诱导效果显著的优点,不仅为快速繁殖优良君迁子无菌苗提供了一条途径,而且为君迁子的工厂化育苗及以后分子育苗提供可能。

技术领域

本发明属于君迁子组织培养领域，具体涉及一种君迁子带芽茎段获得再生植株的方法。

背景技术

君迁子(Diospyros lotus L)是柿科(Ebenacene)柿属(Diospyros L.)落叶乔木，果实营养丰富且具有极高的药用价值，用种子培育的实生苗是优良的嫁接砧木。君迁子果实去涩(经乙醇、CO₂等人工处理)后可生食、酿制果醋与果酒，果实中含有丰富的营养物质，如葡萄糖、蛋白质、脂肪等，可作为粮食食用，其种仁可入药。种子培育的实生苗成活率高，与甜柿嫁接亲和力强，是我国北方柿子的主要砧木品种，也是优良的园林树种。由于君迁子抗寒性较强，在北方温度较低的地方，通常使用播种培育出的君迁子实生苗作为砧木来嫁接繁育柿的其他良种，利用君迁子嫁接可提高在恶劣环境下苗木造林成活率。近年来，随着全球气温升高、气候变化大及降雨量的不均衡，致使柿属植物对于抗逆性砧木的需求增加，目前，抗逆砧木主要是通过实生繁殖，通过无性繁殖及分子育种途径获得抗逆砧木还在起步阶段。君迁子组织培养中还存在诸多问题，比如：外植体褐化严重、无菌苗叶片生长弱、再生效率差及生根培养效果不佳等关键问题，尤其是君迁子增殖苗叶片细小且软的问题严重限制了君迁子遗传转化的相关研究。本发明通过研究不同消毒方法、基础培养基及植物生长调节剂等对君迁子组培苗生长的影响，成功建立了君迁子组织培养再生体系。

发明内容

本发明的目的是针对目前君迁子腋芽为外植体时组培苗褐化严重，通过组织培养获得再生植株技术存在不足的问题，提供一种君迁子半木质化的带芽茎段消毒以及组培快繁的方法。君迁子组织培养方面的研究较少，与之前的相关研究对比分析，该方法萌发率高、生长效果好，明显缩短了君迁子带芽茎段的生长周期，愈伤组织及不定芽诱导率高，叶片数目多、面积大，长势好，根系生长健壮，受材料限制小，为以后工厂化育苗及转基因技术提高可能性。

本发明的目的是通过以下方式实现的。

一种君迁子带芽茎段消毒的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的获得：以君迁子半木质化带芽茎段为外植体材料；

(2)外植体的处理：将君迁子半木质化的带芽茎段切成3-4cm长带单个腋芽的茎段，用洗衣粉清洗2-3次，再用流水冲洗至少30min；

(3)外植体的消毒：将步骤(2)处理过的带芽茎段用75％的酒精浸泡25s，无菌水冲洗至少3次，再用0.1％HgCl₂溶液中浸泡20-30min；优选25min；最后无菌水冲洗3-5次。

本发明的第二个目的是提供一种君迁子带芽茎段为外植体获得组培苗的方法，包括以下步骤：

(1)初代培养：将消毒后的带芽茎段分别接种在1/2MS+1.0-3.0mg/L6-BA+0.4-0.6mg/LNAA的培养基上培养；优选上述本发明的消毒方法获得的带芽茎段；

(2)继代增殖培养：将带芽茎段萌发培养出的健壮幼苗切下接种到1/2MS+1.5-2.5mg/L ZT+0.04-0.06mg/L IAA+1.5-2.5mg/L2IP的培养基中进行增殖培养；

上述方法中，步骤(1)中使用的培养基优选为1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA；步骤(2)中使用的培养基优选为1/2MS+2.0mg/L ZT+0.05mg/L IAA+2.0mg/L2IP。

上述方法中，步骤(1)中带芽茎段萌发时；培养温度为28±1℃，光照培养强度为50-60μmolm^-2/s¹，光照培养时间为14h/d。