[发明专利]kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法和应用

说明书

本发明公开了kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法和应用，利用CRISPR技术在tbx5a基因的第一个外显子设计gRNA序列，和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼kctd10基因自发突变体的单细胞期胚胎中，通过鉴定、筛选和培养获得稳定遗传的kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼。tbx5a基因突变体表现出类似人类心手综合征的心脏畸形等症状，而kctd10和tbx5a双突变体斑马鱼部分缓解心脏环化异常的表型，同时挽救房室间隔标记基因的异位表达，本发明的双突变体模型可作为心手综合症的致病机理和治疗心手综合征的小分子药物筛选的动物模型。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法和应用。

背景技术

先天性心脏病是最常见的先天缺陷，在胎儿致死率中占30％，每1000个新生儿中就有一名患儿出现心脏严重畸形(Moore-Morris，2018)，仍然是一个重要的健康问题。心手综合征是先天性心脏病的一种，其病症为上肢缺损和先天性心脏发育不良(Baban，2014)，早期研究发现心手综合征是由TBX5外显子突变引起的(Alessandro D.Mori，2004)，Holt-Oram综合征(HOS)的特征是上肢缺陷、先天性心脏畸形和心脏传导疾病，大约有85％的患有先天性心脏病的个体是因为TBX5致病性的突变导致的，而患病的父代有50％的机率将致病突变传给子代(McDermott，Deborah A.2004)。

TBX5作为在人类心手综合征中发现的第一个相关的突变基因，在心脏的形态和传导系统发育中具有广泛作用，已有研究表明TBX5是心脏发育的核心转录因子与GATA4、NKX2-5等心脏核心转录因子相互作用调节其他因子的表达(McCulley DJ，BlackBL.2012)。在斑马鱼中，tbx5基因发生加倍，成为tbx5a/tbx5b基因，tbx5a调节心脏的作用对于剂量具有敏感性，Albalat R等人证明tbx5a/tbx5b在功能上冗余，tbx5a集中分布于视网膜、心脏及斑马鱼胸鳍部位，而tbx5b主要分布在视网膜、鱼鳍处(Ricard Albalat，2010)。Deborah M.Garrity等人通过对tbx5a进行敲除，使得突变体斑马鱼出现心包腔肿大、心脏拉长、上肢或胸鳍发育畸形或缺失等表型，构建出心手综合征斑马鱼的疾病模型(Deborah M.Garrity，2002)。2014年，共同第一作者祖尧等研究者发现一株心脏发育畸形的突变体，经鉴定其受累基因为kctd10。经过观察其主要突变表型为心包腔肿大、心脏异常紧缩、心房与心室之间的间隔无法正常形成，心脏扭转环化失败，致使心脏畸形，最终停止血液循环致死，发现kctd10和tbx5a基因在心脏发育中有相互作用关系。斑马鱼心脏发育是受到多基因调控的，并且kctd10和tbx5a对心脏的发育都有至关重要的作用，因此构kctd10和tbx5a基因突变的斑马鱼不仅有利于研究心脏的基因调控网络，还有助于进一步了解心手综合征的发病机制。

目前，CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中常用于单基因突变体的构建，而运用该技术构造双突变体和多基因突变体的斑马鱼的研究不多。心脏的调控网络复杂，心手综合征等先天性心脏病的致病原因很可能是多基因复合调控形成的，因此利用CRISPR基因编辑技术构建双基因突变体来研究心手综合征的致病机理十分必要。使用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼疾病相关基因进行基因敲除构建斑马鱼疾病模型，能够更快速筛选出与疾病有关的药物。斑马鱼的药物筛选通常在活斑马鱼胚胎或幼体中进行，这些胚胎或幼体表现出多种生物过程，并拥有完整的脊椎动物器官系统，与培养细胞相比，斑马鱼可以检测到更广泛的表型(MacRae CA，Peterson RT，2015)。