[发明专利]kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法和应用

权利要求书

1.kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在tbx5a基因的第一个外显子上设计如SEQ ID NO:1所示的gRNA序列；

(2)设计并合成tbx5a的gRNA引物，序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；

(3)以上述gRNA引物和gRNA-plasmid为模板进行PCR反应，电泳检测PCR产物后，进行纯化；

(4)上述纯化后的PCR产物在RNase-Free条件下进行体外转录，纯化，得到gRNA；

(5)纯化后的gRNA和Cas9蛋白显微注射到斑马鱼kctd10基因自发突变体内交的单细胞期胚胎中，敲除成功的鱼养至成年后T7E1酶切检测tbx5a的敲除效率，同时PCR检测kctd10的突变情况，敲除成功的斑马鱼饲养长大，作为F0；

(6)F0斑马鱼性成熟后与野生型的斑马鱼杂交，测序确认有双突变的斑马鱼饲养长大，作为F1；

(7)F1双突变的雌雄斑马鱼配对后，选取kctd10与tbx5a双基因突变斑马鱼，即得。

2.根据权利要求1所述kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法，其特征在于，步骤(3)和(5)中，所述PCR反应的条件为：94℃预变性3min，进入三步循环：94℃-30s、65℃-30s、72℃-40s共34个循环，然后72℃-5min，最后保温在12℃。

3.根据权利要求1所述kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，检测tbx5a敲除效率的方法包括：用碱裂法提取斑马鱼胚胎的DNA，设计序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物对敲除位点进行PCR扩增检测tbx5a敲除效率，设计序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物进行PCR扩增检测kctd10的突变情况。

4.根据权利要求1所述kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法，其特征在于，步骤(7)中，待F1斑马鱼性成熟后雌鱼和雄鱼的鱼尾部分切除进行尾鳍DNA提取，PCR和T7E1酶切确认是否突变，并测序确认突变类型。

5.根据权利要求1-4任一项所述kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法，其特征在于，所述kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼表现出部分缓解单基因突变中心包腔肿胀和心脏环化程度异常的现象。

6.通过权利要求1-5任一项所述kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法得到的kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系在构建与先天性心脏病心手综合征相关的动物模型中的应用。

7.通过权利要求1-5任一项所述kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法得到kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系在药物筛选中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗心手综合征的潜在小分子药物。