[发明专利]一种π-FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用

说明书

本发明公开了一种π‑FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用，所述π‑FISH+核酸探针组包括一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探针和信号探针。本发明设计的π‑FISH+核酸探针组克服了传统荧光原位杂交信号放大能力低、背景噪音大、只能检测长核酸序列等缺点，具有信号放大能力强、特异性高、效率高、背景噪音低等优点；本发明可以检测大于16个碱基的DNA或RNA核酸分子，可实现对长、短核酸序列定性、定量和定位的检测；另外，本发明设计的π‑FISH+核酸探针组可以精准地检测前列腺癌抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7)，指导患者临床治疗，具有巨大的临床应用潜力。

技术领域

本发明属于核苷酸的原位单分子检测技术领域，具体涉及一种π-FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用。

背景技术

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种利用荧光标记的探针在原位上显示核酸空间信息的方法。由于其特异、高效、原位等优势，已经被广泛应用于生物学研究和临床诊断。

随着FISH技术的不断发展与优化，在复杂的细胞和组织环境中，FISH技术经常面临着信号放大能力有限、特异性低，效率低、背景噪音高的挑战，对于一些中高拷贝数靶分子的检测比较有效，对于低拷贝数的靶分子检测效果较差，虽然增加靶标探针的数目可以在一定程度上提高信号的强度，但是需要更长的核酸序列进行杂交，通常需要杂交的靶标序列在1kb左右，这极大限制了对短序列检测的应用。对于一些具有重要功能的短核酸序列RNA、短核酸序列DNA和可变剪切体(alternative splicing)，目前还没有既能产生足够强的信号，又能保证高效和低背景噪音的FISH检测方法。

此外，近年来FISH技术在临床检测中发挥重要作用。研究表明，前列腺癌是目前全球男性发病率最高的癌症，严重威胁着男性的生命健康。在临床治疗中，前列腺癌循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)中雄激素受体剪接变体7(androgen receptorsplice variant 7,ARV7)的表达与新型雄激素受体(AR)靶向治疗的先天和获得性耐药性相关。因此，ARV7可以作为一个生物标志物来监测前列腺癌治疗过程中耐药性的出现，并指导临床治疗。目前，虽然已经有一些方法尝试检测CTCs中的ARV7 mRNA的表达，如基于PCR扩增的技术和基于抗体的检测技术。但是由于雄激素受体剪切变体有多种类型，包括ARV1、ARV2、ARV4、ARV5和ARV7，不同的AR系列剪切变体序列相似性高，因此PCR扩增技术很难将ARV7与其它剪切变体区分开来，同时，当前市面上检测ARV7的抗体，特异性低，检测效果和准确性仍不明确。

有鉴于此，亟需开发出一种信号强度高、效率高、特异性强和背景噪音低的FISH技术实现灵活的对长、短核酸序列进行检测来解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种π-FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用。本发明设计的π-FISH+核酸探针组可灵活的对长、短核酸序列进行定性、定量和定位的检测；具有信号放大能力强、特异性强、效率高、背景噪音低、低成本等优点；同时，还可以精准检测和区分前列腺癌循环肿瘤细胞中的抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7)。

本发明的第一个目的在于提供一种π-FISH+核酸探针组。

一种π-FISH+核酸探针组，包括一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探针和信号探针；具体原理如图1所示，其中，

所述一级π型靶标探针由左右两条探针组成，形成π型结构，所述一级π型靶标探针包括三个区域，分别为π脚区域、π中区域和π顶区域，所述π脚区域的两个脚均与靶标序列互补；

所述二级探针包括3’端和5’端序列区域以及中间序列区域，所述3’端和5’端序列区域均间隔与多个三级探针互补，所述二级探针的中间序列区域与所述一级π型靶标探针的π顶区域互补；