[发明专利]一种π-FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用

权利要求书

1.一种π-FISH+核酸探针组，其特征在于，包括一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探针和信号探针；其中，

所述一级π型靶标探针由左右两条探针组成，形成π型结构；所述一级π型靶标探针包括三个区域，分别为π脚区域、π中区域和π顶区域，所述π脚区域的两个脚均与靶标序列互补；

所述二级探针包括3’端和5’端序列区域以及中间序列区域，所述3’端和5’端序列区域均间隔与多个三级探针互补，所述二级探针的中间序列区域与所述一级π型靶标探针的π顶区域互补；

所述三级探针包括3’端和5’端序列区域以及中间序列区域，所述3’端和5’端序列区域均间隔与多个四级π型探针互补，所述三级探针中间序列区域与所述二级探针3’端和5’端序列区域互补；

所述四级π型探针由左右两条探针组成，形成π型结构，所述四级π型探针包括三个区域，分别为π脚区域、π中区域和π顶区域，所述三级探针3’端和5’端序列区域均间隔与对应所述四级π型探针的两个π脚区域互补；所述四级π型探针的π顶区域与信号探针序列互补。

2.根据权利要求1所述的π-FISH+核酸探针组，其特征在于，所述一级π型靶标探针的两个π脚区域碱基为16～25个，并且两个π脚区域之间间隔1～2个碱基；所述一级π型靶标探针π中区域的两条序列碱基为6～8个，且两条序列间有2～4个碱基互补；所述一级π型靶标探针π顶区域碱基为12～16个。

3.根据权利要求1所述的π-FISH+核酸探针组，其特征在于，所述四级π型探针两个π脚区域的碱基为20～22个，并且两个π脚区域之间间隔1～2个碱基；所述四级π型探针π中区域的两条序列的碱基为6～8个，且两条序列间有2～4个碱基互补；所述四级π型探针π顶区域的碱基为9～20个。

4.根据权利要求1所述的π-FISH+核酸探针组，其特征在于，所述信号探针包括信号探针A和信号探针B，所述信号探针A的5’端部分序列与所述四级π型探针的π顶区域互补，所述信号探针A的3’端部分序列与所述信号探针B的3’端部分序列互补；所述信号探针A和所述信号探针B的序列长度均为36～80个碱基。

5.根据权利要求4所述的π-FISH+核酸探针组，其特征在于，所述信号探针A和所述信号探针B序列均标记有荧光基团，所述荧光基团选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Cy3和Cy5。

6.权利要求1～5任一项所述的π-FISH+核酸探针组在非诊断为目的的核酸原位检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述π-FISH+核酸探针组为两组，为采用不同信号探针标记的第一位置探针组和第二位置探针组，第一位置探针组定位ARV1，ARV2，ARV3，ARV4和 ARV7转录本，第二位置探针组定位ARV5和ARV7转录本。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述π-FISH+核酸探针组检测长、短核酸序列，其中短核酸序列包括短的DNA突变或者缺失、可变剪切体序列、短的RNA序列；所述核酸选自mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、LncRNA和DNA序列；所述核酸序列的长度大于16个碱基。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述核酸序列选自ssDNA、dsDNA序列。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述核酸序列为cDNA序列。

11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述可变剪切体序列为前列腺癌抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7（ARV7）。

12.一种核酸原位检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的π-FISH+核酸探针组。