[发明专利]sgRNA、CRISPR/Cas试剂及其应用

说明书

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种sgRNA、CRISPR/Cas试剂及其应用，该sgRNA、CRISPR/Cas试剂适用于斑马鱼slc25a13基因的编辑。该sgRNA包括如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示序列。该sgRNA可以精准靶向识别斑马鱼slc25a13基因位点，以及基于该sgRNA的CRISPR/Cas技术可以有效敲除斑马鱼slc25a13基因，使得slc25a13基因表达降低，得到的斑马鱼基因敲降突变体在不改变遗传物质情况下获得与Citrin蛋白缺乏综合征相关表型的斑马鱼。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种sgRNA、CRISPR/Cas试剂及其应用，该sgRNA、CRISPR/Cas试剂适用于斑马鱼slc25a13基因的编辑。

背景技术

随着基因工程技术的发展，CRISPR/Cas家族在基因功能研究实验中已成为最炙手可热的研究工具，其中以Cas9、Cas12、Cas13家族等应用最为广泛。这些基因编辑工具能够通过基因敲除或基因敲降来永久或非永久性改变基因，将基因型与表型联系起来，使得正向遗传学研究能更广泛与深入。RNA干扰(RNA interference，RNAi)作为一种“基因敲降(gene knockdown)”技术，广泛应用于遗传性疾病的基因治疗、肿瘤的抑制、转基因植物的研究领域，但在非洲爪蟾(Xenopus)、斑马鱼(Danio rerio)及其它硬骨鱼中却很难实现；MOs(吗啉反义寡核苷酸，Morpholinos)通过阻断蛋白质翻译或剪接来阻断RNA功能，在斑马鱼等模式生物中广泛实施，但MOs高昂的费用、验证方法的繁琐度和实验观察到的MOs引起的毒性、脱靶效应以及突变动物表型不一致的现象使其在两栖类动物、硬骨鱼的基因功能研究中具有一定的局限性。Cas13是一类VI型CRISPR/Cas RNA内切酶，用于RNA敲降、单碱基编辑及核酸检测等领域，在哺乳动物细胞中，Cas13比RNAi有效性及特异性更高。其中，RfxCas13d是Cas13系统中的一种能有效和精确介导斑马鱼胚胎中特定mRNA转录的蛋白。

斑马鱼slc25a13基因位于第19号染色体，CDS区约2,000bp，编码667个氨基酸，蛋白约73kDa，与人SLC25A13蛋白的同源性达82％，目前关于斑马鱼slc25a13基因的注释及功能验证未见相关报道。人类SLC25A13基因编码了一种天冬氨酸(Asp)/谷氨酸转运蛋白Citrin，该蛋白位于线粒体内膜，是天冬氨酸由线粒体至胞浆的重要载体。天冬氨酸进入胞浆后与瓜氨酸在精氨酸琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthetase,ASS)的催化下形成精氨酸丁二酸酯，并进入尿素循环(Urea cycle)。Citrin蛋白缺乏将导致瓜氨酸在血液中积累，引发II型瓜氨酸血症(Type II citrullinemia,CTLN2)。此外，Citrin蛋白缺乏还会导致新生儿肝内胆汁淤积症(neonatal intrahepatic cholestasis,NICCD)和生长迟缓和血脂异常(failure to thrice and dyslipidemia,FTTDCD)。

2013年，斑马鱼完整基因组序列发布及数据库建立，推动了斑马鱼作为脊椎动物模式生物在科学研究领域的广泛应用。不论在环境毒理学研究方向，还是在基因功能研究方向，抑或是高通量药物筛选领域，斑马鱼都是一种良好的动物模型。斑马鱼表现出胰腺、肝脏和脂肪组织的保守功能，可作为代谢性疾病研究的良好动物模型，实现在斑马鱼模型上对葡萄糖内稳态调节、炎症、神经调控代谢功能障碍等表型的动态观测。另外，斑马鱼具有的体型小、成本低、繁殖快、生长快、通量大等特性更加充分发挥了其作为临床前药物筛选模型的潜力。目前未有利用CRISPR/RfxCas13d基因编辑技术产生斑马鱼slc25a13基因敲降模型的报道。

发明内容

针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种sgRNA，该sgRNA可以靶向斑马鱼slc25a13基因，利用CRISPR/Cas基因编辑技术对斑马鱼slc25a13基因进行敲除或敲低。

为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：