[发明专利]一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品及其制备方法

权利要求书

1.一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：

所述的质控品为含有HPV全基因组的人卵巢癌细胞系制备的质控品。

2.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：

所述的含有HPV全基因组的人卵巢癌细胞系为通过将HPV全基因组整合到人卵巢癌细胞系ovcar3基因组中而获得。

3.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：

所述的HPV全基因组连入pcDNA3.1(+)骨架载体系统。

4.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：

所述的HPV全基因组包括高危型HPV全基因组与低危型HPV全基因组。

5.根据权利要求4所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：

所述的高危型HPV全基因组包括HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82。

6.根据权利要求4所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：

所述的低危型HPV全基因组包括HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPV81、HPV83。

7.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：

所述的质控品包括基因组DNA、细胞沉淀、细胞悬液。

8.一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品的制备方法，包括以下步骤：

(1)HPV基因组序列的合成；

(2)HPV质粒的转染；

(3)HPV单克隆筛选及鉴定；

(4)HPV不同拷贝数梯度质控品制备。

9.根据权利要求8所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中HPV基因组序列的两端添加酶切位点，其中5’端的酶切位点为NheI，其中3’端的酶切位点为PmeI；

步骤(2)中转染的方式如下：

通过酶切位点NheI、酶切位点PmeI分别连入pcDNA3.1(+)骨架载体，获得25种HPV分型质粒HPVx-pcDNA3.1(+)，其中x表示具体HPV分型；将上述25种质粒分别转染ovcar3细胞，转染体系配置如下：

buffer：75μL，

HPVx-pcDNA3.1(+)：1μg，

reagent：3.6μL，

将上述配置体系混匀，置于室温下静置10min，混匀后的体系加入提前接种ovcar3细胞系的12孔板中，培养箱中孵育4h-6h后更换正常培养基。

步骤(3)中单克隆筛选及鉴定的具体方法如下：

转染后24h，将细胞培养基换成包含抗生素的G418培养基，进行细胞的筛选；筛选结束后，将剩余的细胞进行单细胞克隆，消化并收集细胞、按照倍比稀释的方法，对细胞准确计数，用培养基将活细胞稀释至5个/mL，并将细胞充分混匀，取10mL细胞悬液，均匀分到一块96孔板中，每孔0.1mL；将细胞放至二氧化碳培养箱中，37℃培养，待细胞克隆形成时，标记有克隆的孔，加入胰蛋白酶消化细胞，取部分细胞作为扩增模板，分别使用引物对克隆进行扩增及sanger测序验证；剩余细胞扩大培养，备用；

步骤(4)中制备的方式如下：

选取HPV全基因组sanger测序验证的克隆，将克隆扩大培养，提取gDNA，采用数字PCR检测挑选的5个克隆中HPV的拷贝数；并以ddPCR鉴定拷贝数为参考，制备不同拷贝数的梯度质控品。

10.根据权利要求8所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品的制备方法，其特征在于：

利用上述步骤(4)中5种HPV整合细胞，分别制备成细胞悬液、细胞沉淀或gDNA形式质控品，HPV拷贝数为1E+02、1E+03、1E+04、1E+05。