[发明专利]一种杂合抗菌肽NK-LPd及其基因、载体、制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种杂合抗菌肽NK‑LPd及其基因、载体、制备方法和应用，采用甘氨酸接头GG串联如SEQ ID NO.4所示的两个Piscidin抗菌肽重复序列和如SEQ ID NO.3所示的NK‑lysin抗菌肽活性片段，得到杂合肽NK‑LPd的氨基酸序列，杂合肽NK‑LPd的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。选用毕赤酵母偏好密码子，设计合成杂合肽NK‑LPd基因，提高在毕赤酵母中的表达效率，酵母表达并且纯化后获得的杂合肽NK‑LPd抗菌活性强、选择性高，可大量制备用于制备抗菌药物、饲料添加剂或免疫增强剂。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种杂合抗菌肽NK-LPd及其基因、载体，还涉及杂合抗菌肽NK-LPd的制备方法和应用。

背景技术

常规抗生素的广泛和不加选择的使用导致了多重耐药细菌的出现和传播，包括对抗生素耐药的病原体。抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)以低浓度靶向多种病原体成为候选药物之一，迄今为止几乎没有证据表明耐药性。然而，天然抗菌肽存在细胞毒性、免疫原性和体内活性丧失等缺陷，克服这些缺陷，将有利于抗菌肽的开发利用。

NK-lysin是一种从细胞毒性T细胞和NK细胞中产生的抗菌肽，含有120～168个氨基酸残基，存在于细胞内毒性颗粒中。NK-lysin属于脂类结合蛋白皂角素相似蛋白(SAPLIP)家族，该家族成员都具有六个保守的半胱氨酸以及一个Saposin B结构域。目前已经有许多研究证实了NK-lysin的短肽具有抗菌作用。例如，NKLP27是半滑舌鳎的27个残基的截短肽，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有裂解活性，通过与脂多糖(LPS)的脂质部分反应而与几种细菌的脂多糖(LPS)结合，进入靶细胞的细胞质中，带正电荷的残基与带负电的DNA发生静电相互作用，导致DNA降解并调节宿主鱼的先天免疫反应。然而NK-lysin跟大多数抗菌肽相比，氨基酸序列较长，使用化学合成的方法有一定的难度。

Piscidin是一种具有广谱活性的线性阳离子α-螺旋肽。Piscidin的第一个阳离子AMP是从杂交条纹鲈鱼中分离出来的，它具有抗菌、抗真菌和抗病毒特性。有研究表明，Piscidin对鱼类和人类病原体以及多重耐药菌(如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌等)敏感。Piscidin通过环孔机制破坏细菌细胞膜。肽的α螺旋插入膜的脂质之间。当Piscidin与酸性磷脂相互作用时Piscidin会在膜上形成环形孔，使病原体的质膜透化。Piscidin家族抗菌肽多为20～26个氨基酸组成的小肽，分子质量较小且容易降解，导致表达产量低，成为其生产应用的主要瓶颈。

目前已经揭示了抗菌肽一系列不同的作用机制，如膜孔形成、DNA复制抑制或其他免疫反应的调节。当同时存在不同的AMP时，可能会根据所涉及的作用机制显示出累加、增强或协同作用，并且AMP还可以与常规抗生素显示协同作用。由于不同的药物靶点需要同时进行多种适应，并且每种化合物的有效剂量较低，因此病原体产生耐药性的可能性降低。然而，多种AMP联合给药需要合成和配制不同的产品，这增加了所涉及的成本增加和治疗失败的可能性。杂合抗菌肽能有效克服这一缺点。因此亟需研发出一种抗菌活性增强、选择性高的NK-lysin和Piscidin杂合抗菌肽。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种杂合抗菌肽NK-LPd；本发明的目的之二在于提供一种编码所述杂合抗菌肽NK-LPd的基因；本发明的目的之三在于提供一种含有所述杂合抗菌肽NK-LPd基因的重组表达载体；本发明的目的之四在于提供含有所述NK-LPd基因或所述重组表达载体的宿主细胞；本发明的目的之五在于提供一种制备所述杂合抗菌肽NK-LPd的方法；本发明的目的之六在于提供所述杂合抗菌肽NK-LPd在制备抗菌药物、饲料添加剂或免疫增强剂中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：