[发明专利]一种可降解羽毛的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种可降解羽毛的基因工程菌及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域，对前期筛选的羽毛降解菌Bacillus sp.JY‑23(保藏号：CCTCC NO：M 20211638)中的角蛋白酶基因Y1_15990进行克隆和异源表达，成功构建了角蛋白酶重组表达工程菌Escherichia.coliBL21(DE3)/pET‑22b(+)‑Y1_15990，该菌株可以在以羽毛为唯一碳氮源的条件下直接降解羽毛，并高效表达角蛋白酶，这相比于传统的以碳水化合物类碳源和有机氮源为培养基组分进行发酵的工程菌，E.coliBL21(DE3)/pET‑22b(+)‑Y1_15990具有鲜明的特色和优点：一方面该菌株可实现羽毛降解和发酵产角蛋白酶的协同，为构建“工程菌降解羽毛‑重组角蛋白酶‑酶法降解羽毛”复合增效工艺奠定了基础；另一方面，该菌株直接以羽毛为底物，可以显著降低重组角蛋白酶的发酵生产成本，利于规模化应用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体讲是一种可降解羽毛的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

羽毛是一类富含角蛋白的家禽加工副产物，随着家禽养殖规模的不断扩大，大量积累的羽毛除一小部分被用于生产羽毛产品及其副产品外，大部分作为垃圾填埋或者直接焚烧，给水、土壤和空气造成极大的污染，也带来天然蛋白资源的严重浪费。

角蛋白是羽毛的主要组成物质，占到羽毛总质量的90％左右。然而羽毛角蛋白结构致密，不溶于水和有机溶剂，并存在大量相互交联的二硫键、氢键和盐键等化学键，因此它对许多蛋白酶的蛋白水解具有极强的抵抗力，在自然条件下很难降解。目前工业降解羽毛角蛋白的方式主要有高温高压水解法、酸碱水解法和物理膨化法，但这些方法存在能耗高、氨基酸营养损失大和环境污染等诸多缺点。

角蛋白酶能够专一性降解角蛋白，不仅绿色环保、经济实用，而且不会破坏氨基酸的天然结构，是一种理想的羽毛角蛋白降解方式。角蛋白酶产生菌的来源与分布十分广泛，然而野生型产角蛋白酶菌株的酶产量较低，难以满足羽毛降解实际所需。

发明内容

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种可降解羽毛的基因工程菌及其构建方法和应用。

本发明的技术解决方案如下：

一种可降解羽毛的基因工程菌，对Bacillus sp.JY-23菌株上的角蛋白酶基因Y1_15990进行克隆和异源表达，利用基因工程技术构建的重组菌。

优选地，所述角蛋白酶基因Y1_15990基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还公开了一种可降解羽毛的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

步骤一：以Bacillus sp.JY-23菌株中角蛋白酶基因Y1_15990的PCR扩增，得到Y1_15990扩增产物；

步骤二：将Y1_15990扩增产物和载体pET-22b(+)用限制性内切酶Quick Cut NcoI和Quick Cut SalI双酶切，双酶切后，利用T4连接酶将目的基因Y1_15990连接到用同样经限制性内切酶酶切过的pET-22b(+)表达质粒上，获得重组表达载体pET-22b(+)-Y1_15990；

步骤三：将重组表达载体pET-22b(+)-Y1_15990转化至E.coli DH5α感受态细胞，经含氨苄青霉素的LB培养基筛选，挑取单克隆进行菌落PCR扩增验证，筛选出阳性克隆菌；

步骤四：从阳性克隆菌中筛选出Y1_15990角蛋白酶基因测序正确的阳性克隆菌；

步骤五：从基因序列正确的阳性克隆菌中抽提pET-22b(+)-Y1_15990质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，构建出重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-Y1_15990。