[发明专利]一种多克隆抗体在制备鉴别微孢子虫试剂中的应用

说明书

本发明提供了一种多克隆抗体在制备鉴别微孢子虫试剂中的应用，属于免疫细胞化学技术和荧光显微技术领域。本发明所述多克隆抗体的抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，经该抗原免疫小鼠后获得多克隆抗体。本发明所述的多克隆抗体标记样品中的海伦脑炎微孢子虫细胞，操作过程简单，具有更高的检测准确性，且易于利用多色荧光标记法进行微孢子虫蛋白的亚细胞定位研究，同时也适用于同属的其它微孢子虫，适用范围广泛。

技术领域

本发明属于免疫细胞化学技术和荧光显微技术领域，尤其涉及一种多克隆抗体在制备鉴别微孢子虫试剂中的应用。

背景技术

微孢子虫是一类专营细胞内寄生的单细胞真核微生物，其中海伦脑炎微孢子虫(Encephalitozoon hellem)是常见的感染人类的一种微孢子虫。海伦脑炎微孢子虫大小为2～4μm，在宿主细胞内，早期脑炎微孢子虫细胞会聚集在被称为“寄生泡”的特殊膜结构中，并在此逐渐发育成熟。

微孢子虫的常规检测方法主要有电镜检测、染色检测、分子生物学方法检测等。电镜检测常用于微孢子虫种属的鉴定，此方法依赖昂贵的设备和复杂的操作，应用具有较大的局限性。染色检测主要依赖成熟孢子孢壁中的几丁质成分为靶标对病原进行标记，如化学荧光增白剂Calcofluor White M2R、Uvitex 2B等；由于几丁质也是真菌中一类含量丰富的成分，这些染色方法在检测过程中也常与真菌等杂质发生交叉反应，检测特异性有待提高。分子生物学方法主要通过PCR技术检测样品中是否存在病原的核酸序列，此方法检测灵敏度较高，但不能直观观测样品中的病原形态。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种多克隆抗体在制备鉴别微孢子虫试剂中的应用，该应用可直观观察样品中病原形态，同时成本较低、特异性较高、操作简便。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种多克隆抗体在制备鉴别微孢子虫试剂中的应用，所述多克隆抗体的抗原氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，所述多克隆抗体的抗原制备方法包括如下步骤：将EhActin基因插入表达载体构建得重组表达质粒，将重组表达质粒转化大肠杆菌，通过IPTG诱导重组蛋白表达；通过镍柱亲和层析纯化诱导表达的重组蛋白，获得鉴别微孢子虫的多克隆抗体的抗原。

优选的，所述重组表达质粒构建用的引物为上游引物EhActin exF和下游引物EhActin exR，所述上游引物EhActin exF核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物EhActin exR核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选的，所述表达载体为pET-32a(+)。

优选的，所述IPTG诱导重组蛋白表达条件为：待含有重组表达质粒的大肠杆菌培养至菌液OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入0.2～1.0mM IPTG，于25～35℃，100～150r/min摇床培养8～12h。

优选的，所述重组蛋白纯化步骤包括：将所述重组蛋白与30～70％Ni-NTA结合，用30～80mM咪唑洗脱，然后用280～320mM咪唑洗脱，获得目的蛋白。

本发明提供了一种鉴别微孢子虫的多克隆抗体，所述多克隆抗体采用以下步骤制备而得：以所述的抗原免疫小鼠，取免疫小鼠的眼球血，收集上层血清，即得含多克隆抗体的血清。

优选的，，所述免疫小鼠的具体步骤包括：免疫3～5次，每次免疫剂量为0.05～0.2mg抗原/只，每次间隔1周。

本发明提供一种鉴别微孢子虫的抗体荧光标记方法，包括如下步骤：固定感染微孢子虫的细胞或微孢子虫成熟细胞悬浮液，依次透化、封闭处理，然后加入制备的多克隆抗体血清孵育，再加入荧光标记二抗孵育，加入抗荧光淬灭剂，封片，荧光共聚焦显微镜下观察。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：