[发明专利]一种多克隆抗体在制备鉴别微孢子虫试剂中的应用

权利要求书

1.一种多克隆抗体在制备鉴别海伦脑炎微孢子虫试剂中的应用，其特征在于，所述多克隆抗体的抗原氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体的抗原制备方法包括如下步骤：

将EhActin基因插入表达载体构建得重组表达质粒，将重组表达质粒转化大肠杆菌，通过IPTG诱导重组蛋白表达；通过镍柱亲和层析纯化诱导表达的重组蛋白，获得鉴别微孢子虫的多克隆抗体的抗原。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组表达质粒构建用的引物为上游引物EhActinexF和下游引物EhActinexR，所述上游引物EhActinexF核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物EhActinexR核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述表达载体为pET-32a(+)。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述IPTG诱导重组蛋白表达条件为：待含有重组表达质粒的大肠杆菌培养至菌液OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入0.2～1.0mMIPTG，于25～35℃，100～150r/min摇床培养8～12h。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述IPTG诱导重组蛋白表达结束后用尿素溶液重悬菌体沉淀，收集上清液。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组蛋白纯化步骤包括：将所述重组蛋白与30～70％Ni-NTA结合，用30～80mM咪唑洗脱，然后用280～320mM咪唑洗脱，获得目的蛋白。

8.一种鉴别海伦脑炎微孢子虫的多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体采用以下步骤制备而得：以权利要求1中所述的抗原免疫小鼠，取免疫小鼠的眼球血，收集上层血清，即得含多克隆抗体的血清。

9.如权利要求8所述的多克隆抗体，其特征在于，所述免疫小鼠的具体步骤包括：免疫3～5次，每次免疫剂量为0.05～0.2mg抗原/只，每次间隔1周。

10.一种以非疾病诊断和治疗目的鉴别微孢子虫的抗体荧光标记方法，其特征在于，包括如下步骤：固定感染微孢子虫的细胞或微孢子虫成熟细胞悬浮液，依次透化、封闭处理，然后加入如权利要求8或9中制备的多克隆抗体血清孵育，再加入荧光标记二抗孵育，加入抗荧光淬灭剂，封片，荧光共聚焦显微镜下观察。