[发明专利]氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D

说明书

一种蛋白序列MINI RFX‑CAS13D，属于生物工程技术领域。本发明的目的是提供一种编辑活性高、CAS13D蛋白小的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX‑CAS13D。本发明氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX‑CAS13D具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，MINI RFX‑CAS13D蛋白是RFX‑CAS13D的人工缺失版本。本发明能精确靶向RNA序列，并产生切割，使RNA断裂损伤，在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种基因编辑技术。

背景技术

CRISPR/Cas13是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免

疫系统。在CRISPR/Cas13系统中，crRNA与Cas13蛋白形成复合体后，Cas13蛋白被激活发生结构改变，crRNA会与靶RNA序列形成互补结构，Cas13蛋白行使切割RNA的功能，使RNA发生断裂损伤。

除了基础科研外，CRISPR/Cas13还具有广泛的临床应用前景。利用CRISPR/Cas13系统做基因治疗时，需要把Cas13和crRNA导入到体内。目前做基因治疗最有效的递送载体是AAV病毒。但是AAV病毒包装的DNA一般不超过4.5kb。RFX Cas13D因为活性高得到广泛应用。但是RFX Cas13D蛋白有987个氨基酸，加上crRNA和启动子，虽然能够包装到AAV病毒中，但是对于连接其它RNA修饰的蛋白却不够，限制了其在临床中的应用。为了解决这个问题，几种小的Cas13被发明出来，包括CAS13X；CAS13BT1；CAS13BT2；CAS13BT3，但是这些Cas13编辑效率低，难以广泛应用。寻找Cas13蛋白小，编辑活性高。

发明内容

本发明的目的是提供一种编辑活性高、CAS13D蛋白小的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D。

本发明氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，MINI RFX-CAS13D蛋白是RFX-CAS13D的人工缺失版本。

本发明 MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA复合体构成CRISPR/Cas13系统，能精确定位靶向RNA序列，并产生切割，使RNA断裂损伤。

本发明缺失片段的选择：

步骤一：根据CAS13D家族蛋白的结构解析文章对蛋白各结构域、功能域以及重要motif进行分析；

步骤二：根据分析结果进行适当判断并进行合理推测；

步骤三：合成推测的蛋白序列，并用实验验证，得到结果，验证推测；

步骤四：根据步骤一到三的结果进行缺失片段的调整，筛选出最优结果，即敲除效率与RFX CAS13D相当、氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D。

本发明MINI RFX-CAS13D氨基酸序列合成步骤如下：

步骤一：合成MINI RFX-CAS13D的氨基酸序列对应的核苷酸序列；

步骤二：将合成序列构建到骨架载体pAB1678 CMV-HIVNES-GS-Cas13bt1

上，即将合成MINI RFX-CAS13D的核苷酸序列将骨架载体上的CAS13bt1的核苷酸序列进行替换，得到CMV-MINI RFX-CAS13D；

步骤三：转化、挑菌、测序，确定目标序列已正确构建到骨架载体上，CMV-MINIRFX-CAS13D的测序结果与我们的预期构建序列一致，得到目标质粒；

步骤四：吸取1μl CMV-MINI RFX-CAS13D质粒转化进DH5α感受态大肠杆菌，涂板，37℃ 12h, 挑取单克隆至摇菌管，37℃ 12h 200rpm，将摇菌管中的液体倒入200ml 液体LB培养基 ，37℃ 12h，用大提质粒试剂盒提取CMV-MINI RFX-CAS13D质粒，完成质粒的扩增。