[发明专利]氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D

权利要求书

1.一种氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，MINI RFX-CAS13D蛋白是RFX-CAS13D的人工缺失版本。

2.根据权利要求1所述的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA复合体构成CRISPR/Cas13系统，能精确定位靶向RNA序列，并产生切割，使RNA断裂损伤。

3.根据权利要求1所述的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：缺失片段的选择：

步骤一：根据CAS13D家族蛋白的结构解析文章对蛋白各结构域、功能域以及重要motif进行分析；

步骤二：根据分析结果进行适当判断并进行合理推测；

步骤三：合成推测的蛋白序列，并用实验验证，得到结果，验证推测；

步骤四：根据步骤一到三的结果进行缺失片段的调整，筛选出最优结果，即敲除效率与RFX CAS13D相当、氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D。

4.根据权利要求1所述的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：MINI RFX-CAS13D氨基酸序列合成步骤如下：

步骤一：合成MINI RFX-CAS13D的氨基酸序列对应的核苷酸序列；

步骤二：将合成序列构建到骨架载体pAB1678 CMV-HIVNES-GS-Cas13bt1

上，即将合成MINI RFX-CAS13D的核苷酸序列将骨架载体上的CAS13bt1的核苷酸序列进行替换，得到CMV-MINI RFX-CAS13D；

步骤三：转化、挑菌、测序，确定目标序列已正确构建到骨架载体上，CMV-MINI RFX-CAS13D的测序结果与我们的预期构建序列一致，得到目标质粒；

步骤四：吸取1μl CMV-MINI RFX-CAS13D质粒转化进DH5α感受态大肠杆菌，涂板，37℃12h, 挑取单克隆至摇菌管，37℃ 12h 200rpm，将摇菌管中的液体倒入200ml 液体LB培养基 ，37℃ 12h，用大提质粒试剂盒提取CMV-MINI RFX-CAS13D质粒，完成质粒的扩增。

5.根据权利要求1所述的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：MINI RFX-CAS13D/crRNA复合体：

（1）MINI RFX-CAS13D必须与crRNA形成MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体才能发挥RNA切割功能；

（2）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：crRNA负责与RNA进行碱基配对，若RNA能够与crRNA完成碱基配对，将会激活MINI RFX-CAS13D；

（3）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：若RNA不能够与crRNA完成碱基配对，RNA会被MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体释放，不会激活MINI RFX-CAS13D；MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体会继续与另一条RNA进行碱基配对；

（4）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：MINI RFX-CAS13D蛋白负责在RNA与crRNA完成碱基配对后，对RNA进行切割；

（5）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体不仅能够切割外源RNA，也能切割内源RNA。

6.根据权利要求5所述的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：MINI RFX-CAS13D/crRNA切割内源RNA的具体步骤及效率检测方法：

步骤一：将质粒CMV-MINI RFX-CAS13D和质粒hU6-crRNA按照转染试剂Hieff Trans TMLiposomal Transfection Reagent的说明书剂量要求转染至HEK293细胞中，细胞已在6-8小时前在六孔板铺匀，转染时的细胞密度在80%；

步骤二： 在细胞培养箱内37℃ 5%CO2 培养， 24h时更换新鲜细胞培养液， 48h收取细胞；

步骤三：提取细胞RNA，RT-QPCR检测Target RNA的量，确定MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体的敲除效率。