[发明专利]极端嗜热古菌重组HhH-GPD蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种极端嗜热古菌Sulfolobus islandicus REY15A重组HhH‑GPD(Sis‑HhH‑GPD)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用基因工程技术，构建了一株表达Sis‑HhH‑GPD蛋白的基因工程菌，该基因工程菌能够高效地表达Sis‑HhH‑GPD蛋白，且后续的纯化步骤简单易行，很容易得到大量重组酶蛋白。该重组Sis‑HhH‑GPD蛋白能够特异性切除DNA中的1‑meA，并且结合含有1‑meA DNA的能力显著地高于结合正常的DNA。本发明所涉及的重组Sis‑HhH‑GPD蛋白作为DNA甲基化的检测试剂，在医疗领域和分子生物学领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及极端嗜热古菌重组HhH-GPD蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

据了解，碱基甲基化是造成DNA中碱基损伤的常见类型之一，细胞内源性和环境中存在的甲基化试剂会引起DNA中碱基的甲基化，目前主要碱基甲基化的种类包括，7-甲基鸟嘌呤(N7-methylguanine, 7-meG)、3-甲基腺嘌呤 (3-methyladenine, 3-meA)、6-甲基鸟嘌呤 (O6-methylguanine, O6-meG)、1-甲基腺嘌呤 (1-methyladenine, 1-meA)、3-甲基鸟嘌呤 (3-methylcytosine, 3-meC)、4-甲基胸腺嘧啶 (O4-methylthymine, O4-meT) 和methyl phosphotriesters (MPT)。研究发现，7-meG、3-meA和O6-meG是DNA甲基化的主要形式，而 1-meA、3-meC、O4-meT和MPT是DNA甲基化相对较少的形式。研究发现，O6-meG和O4-meT，具有高度的基因诱变性和基因毒理性，3-meA、1-meA、3-meC和3-meG能够阻止DNA复制和转录，具有细胞毒理性和相对较低的基因诱变性。因此，不同类型的碱基甲基化会导致基因突变和干扰细胞的DNA复制和修复过程，很有必要检测DNA中的甲基化碱基。现有的检测DNA甲基化方法主要包括超高效液相色谱-串联质谱法、光交联测序、单细胞实时测序等。尽管这些方法能够达到检测DNA甲基化的目的，但是它们仍存在一些局限性，比如步骤繁琐或者设备昂贵。

DNA糖苷酶是一类水解DNA中N-C糖苷键的酶，进而切除DNA中的损伤碱基，因此在DNA损伤碱基修复、避免细胞突变、检测DNA突变方面具有重要的作用。目前，DNA糖苷酶可分为单功能DNA糖苷酶和双功能DNA糖苷酶。单功能DNA糖苷酶仅切除DNA中的损伤碱基，从而形成无碱基位点。而双功能DNA糖苷酶不仅能够切除DNA中特定的碱基，而且还能够进一步在所产生的无碱基位点处切开磷酸二酯键。

HhH (Helix-hairpin-Helix) DNA 糖苷酶超家族目前包括六个家族的成员：Nth、OggI、MutY/Mig、AlkA、MpgII和OggII。HhH DNA 糖苷酶能够切除DNA中脱氨基化碱基、氧化碱基和烷基化碱基等。HhH DNA糖苷酶广泛地分布在细菌、真核生物和古菌中，细菌和真核生物来源的HhH DNA糖苷酶已有较多的研究，而古菌HhH DNA糖苷酶的研究相对较少。冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus REY15A是研究古菌DNA复制和修复的重要模式生物，其基因组编码一种HhH-GPD (Sis-HhH-GPD)蛋白，属于HhH DNA糖苷酶超家族。

发明内容

本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种极端嗜热古菌重组HhH-GPD蛋白及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种无需使用昂贵仪器、无繁琐步骤、实用性强且能高效、特异并灵敏地识别检测DNA甲基化的方法。

本发明提供了一种极端嗜热古菌重组HhH-GPD蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码上述蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。