[发明专利]一种可放大信号的细胞免疫荧光染色方法

说明书

本发明公开了一种可放大信号的细胞免疫荧光染色方法，属于生物技术领域。本发明所述适配体HCR引物锚定于细胞表面靶点，进行HCR反应，延伸出带荧光的HCR产物链，实现细胞免疫荧光染色。本发明相较于传统的抗体染色技术，荧光信号强度提升了1.5倍。

技术领域

本发明涉及一种可放大信号的细胞免疫荧光染色方法，属于生物技术领域。

背景技术

免疫荧光染色是检测细胞表面蛋白质表达情况常用的方法之一。其原理通常是利用能与目标物高特异性识别与结合的抗体携带荧光分子富集于靶点表面，实现对目的蛋白的荧光染色。但对于低丰度靶点，仅仅使用修饰有一个荧光分子的一个抗体靶向识别无法显示出足够的亮度以供观察分析。因此信号放大技术在免疫荧光染色过程中不可或缺，用于增强荧光信号，提高检测灵敏度。

免疫荧光染色中最广泛使用的方法是利用第一抗体识别抗原靶点，而后利用修饰荧光分子的第二抗体靶向识别第一抗体，以此实现靶点可视化。(Han，K.N.，Li，C.A.Seong，G.H.Annu.Rev.Anal.Chem.6，119–141(2013))但每个一抗仅能结合1-2个二抗，而每个二抗也仅能修饰2-3个荧光分子，这种非常初级的信号放大水平制约其输出的信号强度，仅能满足中高丰度靶点的检测需求。同时，抗体本质为蛋白质，但蛋白质易受到温度和pH等因素影响发生变性，这对反应试剂的存储、运输条件提出了较高要求。但凭借简便的操作，传统抗体染色依然成为最实用的染色方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可放大信号的细胞免疫荧光染色方法，可以提升细胞表面蛋白靶点经荧光染色后的信号强度，提升低丰度靶点亮度和检测灵敏度。

本发明将适配体和HCR结合，利用能与目标物特异性识别的适配体将HCR引物锚定于靶点之上，随后添加修饰有荧光分子的发夹探针H1、H2，原位延伸出标记有大量荧光分子的HCR长链，以此实现一种全新的信号放大系统的构建。

适配体是一种利用特定二级结构与靶点高亲和性和高特异性结合的单链DNA片段，其亲和能力与抗体相近，均在KD＝10^-9mol/L左右，且稳定性远超抗体，适配体在干粉状态下可常温储存运输。杂交链式反应(HCR)是一种基于DNA链取代反应的无酶等温信号放大技术。HCR引物可诱发H1探针发夹结构的打开，而展开后的H1可进一步诱发H2探针发夹结构的打开，随后展开后的H2继续诱发H1打开，循环此过程，自组装延伸成一个超长DNA双链。通过在原料H1、H2上修饰荧光分子，即可大量聚集荧光分子，实现荧光信号放大的功能。

为实现上述目的的技术方案为：

本发明提供了一种适配体-HCR引物复合物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种细胞免疫荧光染色试剂盒，包括适配体-HCR引物复合物、发夹探针H1和发夹探针H2。

进一步地，上述技术方案中，所述发夹探针H1为3’端修饰了荧光基团的SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

进一步地，上述技术方案中，所述发夹探针H2为5’端修饰了荧光基团的SEQ IDNO.3所示核苷酸序列。

进一步地，上述技术方案中，所述荧光基团包括Alexa Fluor 488。

本发明还提供了一种可放大信号的细胞免疫荧光染色方法，将适配体-HCR引物复合物锚定于细胞表面，添加发夹探针H1和发夹探针H2，进行原位HCR反应，延伸出带荧光的HCR产物链，实现细胞免疫荧光染色。

进一步地，上述技术方案中，包括如下步骤：

(1)将适配体-HCR引物复合物溶液在85-95℃下加热90-95s，随后室温冷却10-20min，将冷却后适配体-HCR引物复合物溶液稀释于杂交缓冲液中，终浓度为0.25-0.5uM；