[发明专利]一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法，涉及水产动物细胞培养技术领域。该方法包括以下步骤：黄喉拟水龟卵巢组织依次经胶原蛋白酶Ⅰ型和胰蛋白酶消化后，终止消化反应，之后分离得到消化后细胞；所述消化后细胞在完全培养基中经原代培养和传代培养得到所述黄喉拟水龟卵巢细胞。本发明提供的分离培养方法操作方便，培养细胞的成活率高，能够建立稳定的黄喉拟水龟卵巢细胞体外原代及传代培养体系。本发明培养的黄喉拟水龟卵巢细胞系能够成功感染外源基因，为研究黄喉拟水龟生殖发育及相关领域研究提供了体外技术平台。

技术领域

本发明涉及水产动物细胞培养技术领域，特别是涉及一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法。

背景技术

黄喉拟水龟 (Mauremys mutica)俗称石龟、石金龟，隶属龟鳖目(Testudines)、潮龟科(Geoemydidae)、拟水龟属(Mauremys)。黄喉拟水龟生性温顺，体态美观，无异味，有灵性，且是培育绿毛龟的主要基龟品种，观赏价值较高。20世纪90年代以来，黄喉拟水龟人工繁育技术方面取得了较大进展，黄喉拟水龟已成为新兴的大宗淡水养殖龟类。然而，黄喉拟水龟繁殖周期较长，需经过5-6年才能性成熟。

目前，龟鳖动物关于体组织细胞培养存在着生长缓慢、无法稳定传代、生长不稳定等诸多问题，主要原因是没有摸索出龟鳖动物细胞生长的培育条件，而龟鳖动物卵巢细胞的培养也只在中华鳖中有相关报道。然而，黄喉拟水龟卵巢细胞与中华鳖卵巢细胞在细胞的最佳培养条件(温度、pH)、培养基配方上存在着不同，使用中华鳖卵巢细胞的培养基，黄喉拟水龟卵巢细胞无法生长。鉴于此，探寻一种黄喉拟水龟卵巢细胞体外分离培养的方法对于黄喉拟水龟繁殖效率提高及珍稀物种种质资源的保存利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法，以解决上述现有技术存在的问题，能获得高存活率且稳定传代的黄喉拟水龟卵巢细胞系。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

(1)黄喉拟水龟卵巢组织依次经胶原蛋白酶Ⅰ型和胰蛋白酶消化后，终止消化反应，之后分离得到消化后细胞；

(2)所述消化后细胞在完全培养基中经原代培养和传代培养得到所述黄喉拟水龟卵巢细胞；所述完全培养基包括以下成分：杜氏伊格尔培养基13.5-14g/L、HEPES粉末4.76g/L、非必需氨基酸0.01-0.02mM、丙酮酸钠0.1-0.2mM、双抗 penicillin/streptomycin 50-100μM、β-巯基乙醇100-150μM、亚硒酸钠1-2nM、胎牛血清150-200mL/L、鱼血清2-4mL/L、鸡血清10-15mL/L、生长因子5-10ng/L。

进一步地，在步骤(1)中，所述胶原蛋白酶Ⅰ型的工作浓度为1mg/mL。

进一步地，在步骤(1)中，所述胶原蛋白酶Ⅰ型的消化时间为20min。

进一步地，在步骤(1)中，所述胰蛋白酶的质量百分含量为0.025-0.25％。

进一步地，在步骤(1)中，所述胰蛋白酶的消化时间为5～20min。

进一步地，在步骤(1)中，利用胎牛血清终止消化反应。

进一步地，在步骤(2)中，所述完全培养基的pH为7.4～7.6。

进一步地，在步骤(2)中，所述原代培养和传代培养的培养温度为27～29℃。

本发明公开了以下技术效果：