[发明专利]一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法

说明书

本发明公开了一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，向Cellgro基础培养基中加入OK‑432、IL‑2、IL‑15、IL‑21和复合中药提取物得到诱导培养基；向Cellgro基础培养基中加入rhGM‑CSF、rhIL‑4、复合中药提取物得到增殖培养基；无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，然后向其中加入Ficoll分离液，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；将所得外周血单个核细胞稀释，然后加入诱导培养基中重悬，加入anti‑CD137，培养2‑3h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加IL‑2、IL‑15和IL‑21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。

技术领域

本发明涉及NK细胞体外扩增技术领域，尤其涉及一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法。

背景技术

近年来，肿瘤的生物治疗已经成为肿瘤治疗领域研究的热点。NK细胞是一类独立的淋巴细胞群，NK细胞主要通过细胞毒活性而显示生物学效应，可直接杀伤肿瘤细胞、被病毒感染的细胞以及胞内寄生菌等。NK细胞可以识别自身正常细胞和异常组织细胞，其仅杀伤异常细胞而对宿主正常组织细胞没有细胞毒作用。此外，NK细胞通过分泌多种细胞因子，在免疫调节和某些免疫细胞分化中发挥重要作用。

NK细胞具有较广的抗瘤谱，NK细胞杀伤靶细胞的一个重要机制为：释放穿孔素和颗粒酶B引起靶细胞坏死或凋亡。NK细胞在体内接触到肿瘤细胞之后，通过胞吐将含有穿孔素和颗粒酶B的细胞毒性物质释放，穿孔素通过聚合作用在靶细胞表面形成小孔，释放的颗粒酶B进入靶细胞，可通过多种不同途径激起细胞的死亡，如激起caspases的链锁反应，引起靶细胞DNA降解活动，然后裂解致使肿瘤细胞凋亡。

NK细胞是否能够在肿瘤治疗中发挥作用，最大的关键在于细胞的数量和对肿瘤细胞的杀伤能力。然而，NK细胞在体外增殖速度有限，数量上难以满足需要，杀伤活性也有待加强。

忍冬藤，为双子叶植物药忍冬科植物忍冬的茎叶，具有清热，解毒，通络的功效，主治温病发热，热毒血痢，传染性肝炎，痈肿疮毒，筋骨疼痛。文献(李丽萍等.牡丹皮、忍冬藤及泽兰抗肿瘤作用的实验研究[J],中药新药与临床药理,2000-10-30)公开了采用忍冬藤进行小鼠体内抑瘤实验及体外杀瘤细胞实验，忍冬藤抑瘤率30％，IC50为7.31mg/L，95％的可信限为4.56-11.71mg/L。但目前还没有报道过忍冬藤对NK细胞增殖和杀伤活性的影响。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法。

一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：

S1、向Cellgro基础培养基中加入0.6-1.4μg/mL OK-432、450-550IU/mL IL-2、15-25ng/mL IL-15、45-55ng/mL IL-21和0.1-1μg/mL复合中药提取物得到诱导培养基；向Cellgro基础培养基中加入900-1100U/mLrhGM-CSF、450-550U/mL rhIL-4、0.1-1μg/mL复合中药提取物得到增殖培养基；

S2、无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，然后向其中加入相对密度为1.077的Ficoll分离液，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；

S3、将所得外周血单个核细胞稀释至浓度为1-5×10⁵/mL，然后加入诱导培养基中重悬，加入4.5-5.5μg/mL anti-CD137，培养2-3h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加460-540IU/mL IL-2、15-25ng/mL IL-15和45-55ng/mL IL-21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。

优选地，S1中，复合中药提取物为忍冬藤和丹参的提取物。