[发明专利]痰液标本无细胞上清游离DNA二代测序建库、检测方法

说明书

本发明公开了一种痰液标本无细胞上清游离DNA二代测序建库、检测方法。所述痰液标本cfDNA二代测序建库方法包括以下步骤：1)提取、质控：对痰液标本进行化痰处理，离心，从上清液中提取痰液标本的cfDNA，对所述cfDNA进行浓度检测；2)构建文库：使用基因二代测序检测试剂盒进行痰液标本的cfDNA文库的构建，得痰液标本的cfDNA的基因测序文库。本发明通过收集83例痰液标本，同时收集配对肿瘤标本，进行NGS检测及下机数据分析，建立了痰液标本无细胞上清cfDNA进行NGS的文库，并给出了检测前、检测中及检测后数据分析过程中优化方案。

技术领域

本申请保护的检测技术方案可应用于非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)患者痰液标本无细胞上清中游离DNA(cell free DNA，cfDNA)二代测序方法(next generation sequencing，NGS)检测相关驱动基因改变。

背景技术

近年来，靶向药物在NSCLC临床肿瘤治疗中的地位已经确定，即所谓的“精准治疗”。应用靶向药物治疗均需进行不同基因检测，并根据检测结果选择治疗方案。靶向药物治疗耐药患者肿瘤进展后，仍需进行基因改变检测，用于指导后续治疗。所以国内及国外NSCLC诊疗指南均推荐患者常规进行一组驱动基因改变检测，包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、Her-2、C-MET等基因。

传统上认为进行相关驱动基因检测所需标本为肿瘤组织或肿瘤细胞学标本。但是2/3的NSCLC发现是均为晚期，部分患者(特别是高龄老年患者)无法通过有创入侵性检查获得肿瘤标本完成检测。目前液体活检技术，即利用外周血标本检测基因改变，但血标本存在较高检测假阴性率，并且无法在检测前通过病理评估筛选标本以提高检测阳性率。

细胞学标本是传统病理诊断标本类型之一，细胞学标本中的肿瘤细胞驱动基因检测的价值已被临床诊疗指南认可[1]。但部分细胞学标本中肿瘤含量过低无法进行驱动基因检测，但有研究证实此类标本应用无细胞上清中cfDNA可以完成检测[2]。临床收集痰液标本中绝大部分为低肿瘤含量标本，适合应用液体活检技术对痰液标本无细胞上清cfDNA进行基因改变检测。

痰液标本无细胞上清相比肿瘤组织标本、血液标本更有优势，1)获取方便、完全无创；2)肿瘤原位产生的分泌物，比血液标本的检测灵敏度更高；3)晚期NSCLC患者可能出现贫血现象，痰液标本收集无需考虑贫血问题；4)可在检测前通过对痰液标本病理评估提高检测灵敏度；5)痰液标本检测不存在血液标本克隆性造血对检测结果所造成的影响。

在前期的研究数据显示：提取痰液标本无细胞上清cfDNA进行单基因检测(EGFR基因)，通过进一步收集痰液标本研究发现，与应用NGS方法检测一组基因(EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、Her-2、ALK、ROS1、RET、C-MET)之间存在较多差异，而目前国内及国际上尚无痰液标本上清cfDNA相关NGS检测标准化检测方案。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种痰液标本上清cfDNA相关NGS检测标准化检测方案，以来保证检测过程的稳定性及检测结果的准确性。

本发明提供一种痰液标本cfDNA二代测序(NGS)建库方法，包括以下步骤：

1)提取、质控：对痰液标本进行化痰处理，离心，从上清液中提取痰液标本的cfDNA，对所述cfDNA进行浓度检测；

2)构建文库：使用基因二代测序检测试剂盒进行痰液标本的cfDNA文库的构建，得痰液标本的cfDNA的基因测序文库。

所述基因二代测序检测试剂盒可以为厦门艾德10基因NGS检测试剂盒(厦门艾德生物医药有限公司)，构建文库的具体步骤可以按照试剂盒说明进行。