[发明专利]一种高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法

说明书

本发明公开了一种高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法，属于柑橘生物育种技术领域。本发明的方法包括如下步骤：单胚性品种种子实生播种幼苗生长至高度5‑7cm时，用刀片在幼苗第一片真叶以下将其切断保留上胚轴长度2‑3cm；黑暗条件下诱导切口形成愈伤组织；愈伤组织形成后，用浓度为0.0125‑0.1％的秋水仙素溶液处理愈伤组织，光照条件下诱导愈伤组织再生成芽；当芽萌发长出2‑4片真叶时，流式细胞仪倍性鉴定结合柑橘单多胚特异分子标记筛选单胚性四倍体。本发明适用性广，利用愈伤组织单细胞再生的特性，获得的四倍体纯合、嵌合率低，且诱导效率高，方法简便易操作，无需组培，大大提高了柑橘单胚品种四倍体的获得效率。

技术领域

本发明属于柑橘生物育种技术领域，具体涉及一种高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法。

背景技术

柑橘是我国南方最重要的果树，我国柑橘产业近年来迅猛发展，已成为我国南方主产区农村经济的一大支柱产业。无核柑橘因其食用方便、品质优良而备受人们青睐，因此，无核是柑橘重要的育种目标。三倍体由于减数分裂异常，雌、雄配子均不育，是天然的无核类型，培育三倍体是获得柑橘无核种质的重要途径，具有重要育种应用价值。三倍体在柑橘中的自然发生频率低，获得三倍体最有效的育种途径是四倍体与二倍体倍性杂交。其中，以二倍体为母本与四倍体为父本倍性杂交最为常用，但该方法由于杂交时胚乳败育不易获得三倍体种子，需要采用胚挽救技术才能获得杂种苗，费时费力。以单胚四倍体为母本与二倍体倍性杂交，种子发育正常，可省去胚抢救过程，大大提高育种效率。但目前柑橘现有的四倍体资源大多为多胚性，单胚性资源严重缺乏。以多胚四倍体为母本与二倍体倍性杂交，由于母本珠心胚会与有性胚竞争营养空间，会导致三倍体有性胚后期发育不良，同样需要胚挽救来提高三倍体获得率，育种效率低。因此，单胚性四倍体种质创制是突破限制柑橘三倍体育种效率提升这一瓶颈的必要条件，势在必行。

柑橘中，目前获得单胚性四倍体应用最多的方法就是利用秋水仙素诱导。传统方法一般选用种子、成年态的嫩梢或嫰芽为材料进行诱导，普遍存在诱导效率低、成芽困难和嵌合体比率高等问题，难以大规模推广利用。

发明内容

针对现有技术诱导柑橘品种产生四倍体存在诱导效率低、成芽困难和嵌合体比例高等缺陷，本发明的目的在于提供一种高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法：即单胚性品种种子实生播种幼苗生长至高度5-7cm，用刀片在幼苗第一片真叶以下将其切断，保留上胚轴长度2-3cm；黑暗条件下诱导切口形成愈伤组织；愈伤组织形成后，用质量分数比为0.0125％-0.1％的秋水仙素溶液处理愈伤组织，光照条件下诱导愈伤组织再生成芽；当芽萌发长出2-4片真叶时，流式细胞仪倍性鉴定结合柑橘单多胚特异分子标记筛选单胚性四倍体。该方法利用愈伤组织单细胞再生的特性，获得的四倍体纯合、嵌合率低，且诱导效率高，方法简便易操作，无需组培，大大提高了柑橘单胚品种四倍体的获得效率。

为达到上述目的，本发明具体的技术方案如下：

一种高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法，包括以下步骤：

(1)将种子从柑橘单胚性品种成熟果实取出，去除果胶后，剥去外种皮；培养箱中催芽，种子胚根萌发后移栽至营养钵培养。

(2)柑橘实生幼苗生长到高度5-7cm，用刀片在幼苗第一片真叶以下将其切断，同时去除侧芽，保留上胚轴长度2-3cm，切口保持湿润，避光条件下促进愈伤组织形成。其中，切口保持湿润优选通过将吸头倒扣于切口上实现。

(3)切口愈伤组织形成后，用秋水仙素溶液浸泡处理，用保鲜膜包裹营养钵顶部保持切口湿润，置于光照条件下促进愈伤组织生芽。

(4)愈伤组织再生出芽后待其萌发长出2-4片真叶时，筛选单胚性四倍体。

进一步地，所述的高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法，包括以下步骤：