[发明专利]具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用。该酶的酶原突变体包括由初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽，初始胰蛋白酶原来源于Fusarium oxysporum，突变为初始胰蛋白酶原缺失信号肽序列、且前导肽序列由酶切割位点替换。上述重组胰蛋白酶能够在E.coli BL21(DE3)中表达，且其比酶活为20836.2U/mL；在4℃下能放置6个月内活性不降低；30℃下放置1周活性不降低，放置3个月活性损失不超过10％；在37℃下放置7天还能保留50％以上的活性，稳定性较高。上述重组胰蛋白酶能够用于制备重组胰岛素、细胞培养、蛋白质的酶解及测序、组织细胞的消化。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用。

背景技术

胰蛋白酶(trypsin)是一种丝氨酸蛋白酶，可特异性切割赖氨酸和精氨酸残基的C末端肽段。胰蛋白酶被广泛应用于皮革、医药、生物技术和食品加工等产业，例如在动物细胞培养中消化细胞，在质谱检测中消化蛋白质，在生物制药工业中将单链胰岛素前体转化为双链胰岛素，以及用于增强轮状病毒感染率。

胰蛋白酶在微生物细胞中不能单独有效地表达，因为微量的活性胰蛋白酶的存在就可对宿主细胞产生毒性。研究以胰蛋白酶原的形式在酵母细胞中完成表达，但获得的胰蛋白酶稳定性较差，并且酵母细胞的生长周期长，不利于胰蛋白酶的快速生产。大肠杆菌生长快、培养周期短、遗传背景清楚、表达系统成熟完善，是快速生产胰蛋白酶的更优选择。但相对于胰蛋白酶，胰蛋白酶原的结构更加复杂，在大肠杆菌中很难表达。

发明内容

基于此，有必要提供一种稳定性较高的重组胰蛋白酶，该重组胰蛋白酶的酶原突变体能够在大肠杆菌中表达。

一种重组胰蛋白酶，所述重组胰蛋白酶的酶原突变体包括由初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽，所述初始胰蛋白酶原来源于Fusarium oxysporum，所述突变为所述初始胰蛋白酶原缺失信号肽序列、且前导肽序列由酶切割位点替换。

本研究通过对来源于Fusarium oxysporum的初始胰蛋白酶原进行突变，使其缺失信号肽序列，且将其前导肽序列由酶切割位点替换，得到的酶原突变体能够在大肠杆菌中高效表达。经试验验证，上述重组胰蛋白酶能够在E.coli BL21(DE3)中表达，且其比酶活为20836.2U/mL；在4℃下能放置6个月内活性不降低；30℃下放置1周活性不降低，放置3个月活性损失不超过10％；在37℃下放置7天还能保留50％以上的活性，稳定性较高。

其中一个实施例中，所述初始胰蛋白酶原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

其中一个实施例中，所述突变为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列缺失第1位至第17位的氨基酸、且第18位至第24位的氨基酸突变为酶切割位点。

其中一个实施例中，所述酶切位点包括肠激酶切位点、Xa因子蛋白酶切位点、Furin蛋白酶切位点或者SUMO蛋白酶切位点。

其中一个实施例中，所述酶切割位点为肠激酶切割位点，所述肠激酶切割位点的氨基酸序列为TDDDDK。

其中一个实施例中，所述初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽包括：如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列，或者与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少98％同源性的氨基酸序列，或者由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的氨基酸序列。

其中一个实施例中，所述酶原突变体的核苷酸序列包括：

(a)、由如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；

(b)、与如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸；或，