[发明专利]具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组胰蛋白酶，其特征在于，所述重组胰蛋白酶的酶原突变体包括由初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽，所述初始胰蛋白酶原来源于Fusarium oxysporum，所述突变为所述初始胰蛋白酶原缺失信号肽序列、且前导肽序列由酶切割位点替换；所述初始胰蛋白酶原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述突变为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列缺失第1位至第17位的氨基酸、且第18位至第24位的氨基酸突变为酶切割位点，所述酶切割位点为肠激酶切割位点，所述肠激酶切割位点的氨基酸序列为TDDDDK，所述初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述重组胰蛋白酶的比酶活在20836.2U/mL以上；在4℃下放置6个月内酶活性不降低，在30℃下放置1周酶活性不降低，在放置3个月酶活性损失不超过10％，在37℃下放置7天能保留50％以上的酶活性；

其中，所述重组胰蛋白酶主要通过如下步骤制备得到：

通过大肠杆菌重组表达所述重组胰蛋白酶的酶原突变体，得到重组大肠杆菌的培养液；

对所述重组大肠杆菌的培养液进行固液分离，收集菌泥沉淀；

对所述菌泥沉淀进行破碎处理，然后进行变复性处理，获得含有所述酶原突变体的复性液；其中，对所述菌泥沉淀进行破碎处理，然后进行变复性处理的步骤包括：以0.1g/mL的菌体终浓度将所述菌泥沉淀与重悬缓冲液混合，获得悬浮液Ⅰ；所述重悬缓冲液含有20mMTris-HCl，0.5mM EDTA，pH 8.0±0.2；对所述悬浮液Ⅰ进行细胞破碎，获得细胞破碎液；对所述细胞破碎液进行固液分离，收集细胞破碎沉淀并与洗涤缓冲液Ⅰ混合，获得悬浮液Ⅱ，所述洗涤缓冲液Ⅰ与所述重悬缓冲液体积比为1，所述洗涤缓冲液Ⅰ含有20mM Tris-HCl，500mMNaCl，1mM EDTA，1％Tritone，pH 8.0±0.2；对所述悬浮液Ⅱ固液分离，收集沉淀并与洗涤缓冲液Ⅱ混合，获得悬浮液Ⅲ；所述洗涤缓冲液Ⅱ与所述重悬缓冲液体积比为1，所述洗涤缓冲液Ⅱ含有20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0±0.2；对所述悬浮液Ⅲ固液分离，收集沉淀并与变性缓冲液Ⅰ混合，获得悬浮液Ⅳ；所述变性缓冲液Ⅰ与所述重悬缓冲液的体积比为15:100，所述变性缓冲液Ⅰ含有20mM Tris-HCl，0.5mM DTT，pH 8.0±0.2；将所述悬浮液Ⅳ与变性缓冲液Ⅱ混合，获得变性液；所述变性缓冲液Ⅱ与所述重悬缓冲液的体积比为85:100，所述变性缓冲液Ⅱ含有20mM Tris-HCl，6M尿素，0.5mM DTT，pH8.0±0.2；将所述变性液与复性缓冲液混合，获得含有目的蛋白的复性液；所述复性缓冲液与所述重悬缓冲液的体积比为9:1，所述复性缓冲液含有20mM Tris-HCl，20mM NaCl，2mM MgCl₂，5％甘油，pH8.0±0.2；

对所述复性液进行过滤处理，然后采用pH 8.0、20mM Tris-HC buffer进行液体置换，得到含有所述酶原突变体的处理液；

采用肠激酶激活所述酶原突变体，得到含有具有活性的重组胰蛋白酶的处理液；

将所述含有具有活性的重组胰蛋白酶的处理液上样至经平衡缓冲液平衡后的柱子中，所述柱子中装填有苯甲眯-琼脂糖凝胶，所述平衡缓冲液的主要组分为：50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.4；

采用洗脱缓冲液对上样后的所述柱子进行洗脱并收集洗脱液，然后采用透析缓冲液对所述洗脱液进行液体置换，得到所述重组胰蛋白酶，所述洗脱缓冲液的主要组分为：10mMHCl，500mM NaCl，pH 2.0，所述透析缓冲液的主要组分为：10mM PBS buffer，1mM EDTA，pH7.0。

2.根据权利要求1所述的重组胰蛋白酶，其特征在于，所述酶原突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述的重组胰蛋白酶的酶原突变体的核苷酸序列。

4.一种重组工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体。