[发明专利]一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体

说明书

本发明提供了一种7β‑羟基甾体脱氢酶突变体，其氨基酸序列选自SEQ ID Nos.3‑5。该7β‑羟基甾体脱氢酶突变体能够在高底物浓度下快速催化7‑羰基石胆酸转化为熊去氧胆酸，具有工业化应用前景。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体及其在催化合成熊去氧胆酸中的应用。

背景技术

熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，又名乌索去氧胆酸、熊脱氧胆酸，是鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)的7β-羟基差向异构体，其化学结构式如下所示：

熊去氧胆酸是名贵中药熊胆粉的活性药物成分，临床上用于治疗胆固醇性结石和胆汁淤积性肝病。1997年，熊去氧胆酸成为第一个被美国食品药品监督管理局(FDA)批准治疗原发性胆汁性肝硬化(PBC)的药物。目前，熊去氧胆酸主要从熊胆中提取和化学合成。近年来，利用生物催化技术合成熊去氧胆酸由于具有反应条件温和、选择性高、绿色环保等优点，受到极大关注。其中7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)是酶法合成熊去氧胆酸过程中最为重要的关键酶，其催化性能好坏直接决定了熊去氧胆酸的生产成本和产品质量。

2015年，华东理工大学许建和等从瘤胃球菌(Ruminococcus torques)中挖掘得到一个新的Rt7β-HSDH，也是当时第四个报道基因序列的7β-HSDH酶，通过进化改造得到活性提高5.5倍、40℃半衰期提高3倍、最适pH从弱酸性偏移至弱碱性的突变体Rt7β-HSDH_T189V/V207M，并通过两步酶法级联反应成功将鹅去氧胆酸高效地转化为熊去氧胆酸。但是Rt7β-HSDH的比活力依然不高，并且伴有严重的底物和产物抑制，导致最终的底物上载量仅为40g/L(Process Biochemistry,2015,50(4):598–604；Journal of Agricultural andFood Chemistry,2017,65:1178-1185；CN107099516A；CN108546691A)。

2019年，中国科学院天津工业生物技术研究所朱敦明等人利用基因组挖掘策略，最终获得来源于Clostridium sp.Marseille的Cm7β-HSDH，其比活力达到26.5U mg^-1，将其与7α-HSDH耦联后，可将10～60g/L鹅去氧胆酸完全转化为熊去氧胆酸，转化率大于98％(Advanced SynthesisCatalysis,2019,361:2497–2504；CN109722442A)。

2021年，专利文献CN113416717A公开了一种通过分子改造得到酶比活力提高2.59倍的7β-HSDH，虽然该7β-HSDH酶的活力有一定程度提升，但是仍不够显著，它仅能催化50g/L底物7-羰基石胆酸转化为熊去氧胆酸，不利于工业规模化应用。

综上所述，通过酶法催化7-羰基石胆酸(7-oxo-LCA)的不对称还原反应合成熊去氧胆酸，具有立体选择性高和环境友好等优势，已有诸多相关报道，并取得了一定进展。但是，现有技术的7β-羟基甾体脱氢酶依然存在许多不足之处，例如我们通过实验验证发现目前公开报道的许多7β-羟基甾体脱氢酶的催化活性实际上都较低，存在对底物/产物浓度的耐受性较差以及整体生产效率不高等问题。

发明内容

为了开发催化性能更好的酶催化剂，以满足催化转化效率高、底物上载量高和时空产率高等工业化应用的需求，我们在之前CN107099516A和CN108546691A的Rt7β-HSDH研究基础上继续进行酶突变体的发掘，筛选出多个综合性能进一步提高的7β-羟基甾体脱氢酶突变体，具有比活力更高、反应底物浓度高、热稳定性更好等优点。具体地，本发明包括如下技术方案。

一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体，其选自下组：