[发明专利]一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用

说明书

本发明涉及一种苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用。克隆出具有如SEQID No.2所示核苷酸序列的苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶hPNMT54基因，并转入E.coliBL21(DE3)中表达，获得了苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶hPNMT54酶。对hPNMT54酶学性质研究表明，在温度50℃、pH7.5时活力最佳；Nisupgt;2+/supgt;对酶活抑制作用较大。此外，苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶hPNMT54在催化合成肾上腺素时，其制备方法简单、环境友好、反应条件温和，具有很好的工业化生产前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用。

背景技术

肾上腺素(Adrenaline)，化学名为(R)-1-(3’,4’-二羟基苯基)-2-甲胺基乙醇，由美国Forest Labs公司研发。肾上腺素具有两个对映体，R-(-)和S-(+)，其中R-(-) -肾上腺素具有生理活性，是危重患者的一种抢救药品，肾上腺素的需求量也集聚扩增。因此，(R)-肾上腺素的绿色生物合成将为拯救更多危重患者提供药物保障，同时为其它以1,2-氨基醇为骨架的生物活性物质合成提供参考。

肾上腺素是一种激素和神经传送体，由肾上腺释放。当人经历某些刺激时会分泌出，使人呼吸加快，心跳与血液流动加速等。同时肾上腺素会使心脏收缩力上升，使心脏、肝、和筋骨的血管扩张和皮肤、粘膜的血管收缩，拯救濒死的人或动物。该物质易被氧化，氧化颜色变化为浅粉色至红棕色，且在水中溶解性极低，其盐酸盐易溶于水。该物质具有一定的应用价值，可用于心脏骤停的抢救和过敏性休克的抢救，挽救患者生命；可用于过敏性疾病(如支气管哮喘、荨麻疹)的治疗；还可与局麻药合用有利局部止血和延长药效等。

同时，肾上腺素作为危重患者的一种抢救药品，具有重要的利用价值，因此需加强对肾上腺素作用机理与合成途径的研究，采取相对安全、高效的合成途径。目前化学合成方法具有收率低、环境污染较重、使用昂贵金属催化剂等问题。生物合成方法中，苯乙醇胺-N-甲基转移酶(phenylethanolamine-N-methyltransferase，PNMT)是关键酶，该酶催化将甲基从 S-腺苷蛋氨酸转移到去甲肾上腺素的氨基端生成肾上腺素。PNMT多数情况下来源于动物，基因复杂度较高；是以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体，属于甲基转移酶(MTs)小分子亚家族。利用苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化去甲肾上腺素合成肾上腺素，反应条件温和，绿色环保且无污染物生成。可解决目前化学合成的收率低、环境污染较重、使用昂贵金属催化剂等问题。

因此，通过酶祖先序列重建技术，挖掘具有较高活力的苯乙醇胺-N-甲基转移酶对催化合成肾上腺素具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用。该酶来源于现有人源苯乙醇胺-N-甲基转移酶(hPNMT)的祖先序列挖掘，该酶最适温度为50℃，最适pH为7.5，在pH5.0-8.5，酶活仍保持50％以上，表明hPNMT54稳定性较高；Ni²⁺离子对hPNMT54活力具有较大的抑制作用，2h内，hPNMT54催化合成0.4g/l肾上腺素，转化率达43％。利用苯乙醇胺-N-甲基转移酶，以去甲肾上腺素和S-腺苷蛋氨酸为底物，生物催化合成肾上腺素，反应条件温和，绿色环保且无污染物生成。但其酶活较低，催化合成肾上腺素产量较低。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54，所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：