[发明专利]一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用

权利要求书

1. 一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54，其特征在于，所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种重组质粒，其特征在于，表达含有编码权利要求1所述的苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的基因。

3.一种重组菌株，含有权利要求2所述的重组质粒。

4. 一种克隆表达权利要求1所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1，构建表达苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54的基因工程菌pET24a-hPNMT54-E.coli BL21（DE3）

根据酶祖先序列重建技术挖掘出的祖先酶基因序列进行密码子优化后，全基因合成该基因序列，亚克隆到载体pET24a上，获得重组质粒pET24a-hPNMT54，将构建好的重组质粒pET24a-hPNMT54用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得苯乙醇胺-N-甲基转移酶的表达菌株pET24a-hPNMT54-E.coli BL21（DE3）；

步骤2，体外诱导表达

将苯乙醇胺-N-甲基转移酶的表达菌株pET24a-hPNMT54-E.coli BL21（DE3）接入5ml含卡纳霉素的LB培养基中离心管中，于25-40℃过夜培养10-20h后，按1%的接种量接种到100ml含卡纳霉素的LB培养基中，当OD₆₀₀=0.4-0.8时，加入终浓度0.25 mM-1 mM的IPTG，15-30℃，150-250 rpm培养15-20h；

步骤3，苯乙醇胺-N-甲基转移酶的获得

体外诱导表达结束后于4℃，4000-8000 rpm离心10-15 min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体3次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎，每次10-15min，超声2秒间隔3秒，然后于4℃，6000-12000rpm离心10-15 min收集上清液后，纯化处理，即得苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54酶液。

5.权利要求4所得苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54酶液在催化合成肾上腺素中的应用。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述催化合成的温度为37℃、反应体系的pH 7.0。