[发明专利]一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶的高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶的高通量筛选方法。在酶标仪的96孔板中加入底物去甲肾上腺素和S‑腺苷蛋氨酸、PBS缓冲液、S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸水解酶SAHH，加入酶样品苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶，在微孔板震荡反应器中，20‑50℃，500‑1000rpm，反应1‑3h，4℃，3700rpm离心，取上清，再加入化合物NDCC反应0‑90min，反应过程中每隔1‑30min取出酶标板，酶标测定其吸光值；根据吸光值变化，酶活定义为在特定条件下，每分钟OD405nm吸光值的变化*1000000。本发明具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，对苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶的定向进化具有深远意义。

技术领域

本发明涉及高通量筛选技术，具体涉及一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶的高通量筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

苯乙醇胺-N-甲基转移酶(phenylethanolamine-N-methyltransferase，PNMT)是催化将甲基从S-腺苷蛋氨酸转移到去甲肾上腺素的氨基端生成肾上腺素反应的酶。利用苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化去甲肾上腺素合成肾上腺素，反应条件温和，绿色环保且无污染物生成，在生物催化和生物医药领域都有广泛的应用。

新型酶的发现可以通过自然突变的方法筛选得到，但是这种方法效率低、目标性较差，需建立快速高效的新方法。采用分子改造的方法，筛选获得新型的苯乙醇胺-N-甲基转移酶。用分子改造的方法对现有的酶进行突变时，通常会形成数量巨大的文库，从而高通量检测方法成为筛选时的关键方法。目前使用较普遍的筛选方法为高效液相色谱(HPLC)，该方法分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，应用范围广；但该方法检测成本高，分析时间较长，不能提高筛选效率。

因此，开发一种高通量筛选苯乙醇胺-N-甲基转移酶的方法对苯乙醇胺-N-甲基转移酶的定向进化具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高通量筛选苯乙醇胺-N-甲基转移酶的方法。

为解决上述技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶的高通量筛选方法，在酶标仪的96孔板中加入底物去甲肾上腺素和S-腺苷蛋氨酸、PBS缓冲液、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶SAHH，然后分别加入苯乙醇胺-N-甲基转移酶样品与无酶空菌样品pET24a/E.coli BL21(DE3)的酶液，在微孔板震荡反应器中，20-50℃，500-1000rpnm，反应1-3h，4℃，3700rpm离心10min，取上清再加入NDCC化合物，反应0-90min，反应过程中每隔1-30分钟取出96孔板，分别酶标测定其在405nm处的吸光值大小；根据吸光值变化，酶活定义为在特定条件下，每分钟OD405 nm吸光值的变化*1000000；

所述化合物NDCC的合成方法为：0.1-0.2g的5-硝基水杨醛，0.1-0.2g的2-环戊烯-1-酮和0.05-0.1g的咪唑溶解在四氢呋喃1.5mL与去离子水1.5mL的混合溶液中，20℃下搅拌过夜，之后用去离子水稀释4.3倍，并用乙酸乙酯萃取，合并有机组分，并用真空抽滤去除乙酸乙酯，然后通过快速色谱纯化NDCC。

所述酶样品为苯乙醇胺-N-甲基转移酶，酶来源参考专利：一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶hPNMT54及其克隆表达与应用。

本发明所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶的高通量筛选方法，所述的苯乙醇胺-N-甲基转移酶为催化去基肾上腺素合成肾上腺素的甲基转移酶。

本发明所述的利用化学合成的NDCC化合物检测的原理为：苯乙醇胺-N-甲基转移酶将S-腺苷蛋氨酸的甲基转移到去甲肾上腺素的氨基端生成肾上腺素，S-腺苷蛋氨酸会生成其副产物S-腺苷同型半胱氨酸，该副产物在S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAHH)水解成腺苷和同型半胱氨酸，NDCC化合物可检测同型半胱氨酸，于405nm处产生吸光值变化，且由无色变为黄色，检测较灵敏。