[发明专利]一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶的高通量筛选方法

权利要求书

1.一种苯乙醇胺-N-甲基转移酶的高通量筛选方法，其特征在于，在酶标仪的96孔板中加入底物去甲肾上腺素和S-腺苷蛋氨酸、PBS缓冲液、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶SAHH，然后分别加入苯乙醇胺-N-甲基转移酶样品与无酶空菌样品pET24a/E.coli BL21(DE3)的酶液，在微孔板震荡反应器中，20-50℃，500-1000rpnm，反应1-3h，4℃，3700rpm离心10min，取上清再加入NDCC化合物，反应0-90min，反应过程中每隔1-30分钟取出96孔板，分别酶标测定其在405nm处的吸光值大小；根据吸光值变化，酶活定义为在特定条件下，每分钟OD405nm吸光值的变化*1000000；所述化合物NDCC的合成方法为：0.1-0.2g的5-硝基水杨醛，0.1-0.2g的2-环戊烯-1-酮和0.05-0.1g的咪唑溶解在四氢呋喃1.5mL与去离子水1.5mL的混合溶液中，20℃下搅拌过夜，之后用去离子水稀释4.3倍，并用乙酸乙酯萃取，合并有机组分，并用真空抽滤去除乙酸乙酯，然后通过快速色谱纯化NDCC。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤中，所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤中，所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤中，所述无酶空菌pET24a/E.coliBL21(DE3)的质粒序列如SEQ ID No.3所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苯乙醇胺-N-甲基转移酶通过以下步骤所得：

步骤1，构建表达PNMT的基因工程菌pET24a-hPNMT54-E.coli BL21(DE3)

根据酶祖先序列重建技术挖掘出的氨基酸祖先序列进行密码子优化后，全基因合成该序列，亚克隆到载体pET24a上，获得重组质粒pET24a-hPNMT54，将构建好的重组质粒pET24a-hPNMT54用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得苯乙醇胺-N-甲基转移酶的表达菌株pET24a-hPNMT54-E.coli BL21(DE3)；

步骤2，体外诱导表达

将苯乙醇胺-N-甲基转移酶的表达菌株pET24a-hPNMT54-E.coli BL21(DE3)接入96深孔板中，其中每孔添加300-500μl含终浓度50μg/mL卡纳霉素的LB培养基，于25-40℃过夜培养10-20h后，再添加1ml含终浓度50μg/mL卡纳霉素的LB培养基，当OD600＝0.4-0.8时，加入终浓度0.25mM-1mM的IPTG，15-30℃，500-1000rpm培养15-20h；

步骤3，苯乙醇胺-N-甲基转移酶的获得

体外诱导表达结束后于4℃，3000-8000rpm离心10-15min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体3次，再用PBS缓冲液重悬菌体。