[发明专利]基于氟代吡啶型化合物的蛋白质-蛋白质偶联方法

说明书

一种基于氟代吡啶型化合物(5‑氟‑4‑苯砜基‑吡啶甲醛，FPPA)的蛋白质‑蛋白质偶联方法，属于蛋白质定点修饰及蛋白质‑蛋白质偶联领域。所述蛋白质‑蛋白质偶联可以通过两种方式完成：(1)氟和苯砜基的分步离去(2)氟的离去及醛基的成环反应。偶联完成后，FPPA中仍存在第三个活性官能团，可用于三组分多功能生物大分子的构建。所有反应均在水溶液中完成，产率高，化学选择性强，产物均一，且所有蛋白质均可来自基因重组，不需要任何额外的化学修饰，为生物化学研究领域中生物分子的偶联提供了一种强有力的工具。

技术领域

本发明属于蛋白质修饰及蛋白质-蛋白质偶联领域，具体涉及了一种基于氟代吡啶型化合物的蛋白质-蛋白质偶联新方法。

背景技术

保留蛋白质天然功能的共价修饰，尤其是可以应用于生物大分子偶联的共价修饰，如蛋白质-蛋白质偶联，一直以来都是化学生物学研究者追求的目标，这对于探索蛋白质结构与功能的关系、开发新的药物疗法以及提供蛋白质合成新路径至关重要。共价修饰的高效性、特异性，产物的均一性往往是衡量蛋白质修饰及偶联的重要标准。

点击化学(click chemstry)通过叠氮-炔的环加成反应成功地应用于蛋白质-蛋白质偶联，该反应特异性高、产物均一(Nat.Protoc.,2015,10:1594～1611)。但是其往往需要将非天然氨基酸插入到蛋白质片段以引入特定官能团，这大大增加了蛋白质偶联的难度，限制了其应用范围。

α-酮酸-羟胺连接(α-ketoacid-hydroxylamine ligation)通过α-酮酸和羟胺之间的脱羧缩合反应进行蛋白质偶联，不需要非天然氨基酸的插入(Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45:1248～1252)。但是蛋白质碳端酮酸及氮端羟胺的引入往往需要借助于肽的化学合成来完成，这大大限制了偶联产物的大小。且反应条件激烈(共溶剂，酸性，60℃)，偶联产物需复性。

天然化学连接(native chemical ligation)通过蛋白质碳端α-硫酯和氮端半胱氨酸之间的分子内重排反应将蛋白质进行偶联，反应较快、产率高，且产物通过天然肽键连接(Science,1994,266:776～779)。但是蛋白质中α-硫酯的引入往往需要额外的化学修饰来完成，硫酯中间体易水解，对偶联产物的均一性有一定影响，且偶联产物需复性。

表达蛋白连接(expresssed protein ligation)通过Intein融合蛋白的硫解，可在目的蛋白碳端引入α-硫酯，进而与半胱氨酸反应完成蛋白质-蛋白质偶联(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:6705～6710)。但是，硫酯中间体的水解、副反应的发生等问题并没有得到解决。

肽酰肼的天然化学连接(native chemical ligation of peptide hydrazides)通过以酰肼作为硫酯的替代物，可成功地应用于蛋白质-蛋白质偶联(Angew.Chem.Int.Ed.,2011,123:7787～7791)。酰肼相对于硫酯而言更加稳定，且更容易通过化学合成方法获得，但是反应过程中激烈的反应条件(NaNO₂,pH 3.0,6M Gn·HCl)、中间体的水解、产物的复性等问题仍然存在。

丝氨酸/苏氨酸连接(serine/threonine ligation)可以通过蛋白质碳端水杨醛酯和氮端丝氨酸、苏氨酸之间的成环及分子内重排反应将蛋白质进行偶联(Org.Lett.,2010,12:1724～1727)，但是水杨醛酯的引入同样需要肽的化学合成来完成，且反应条件激烈，产物需要复性。