[发明专利]基于FRET的DNA损伤检测方法及功能蛋白

说明书

本发明公开了一种基于FRET的DNA损伤检测方法及功能蛋白。利用耐辐射奇球菌中的阻遏蛋白DdrO，将黄色荧光蛋白eYFP和青色荧光蛋白eCFP分别连接于其N端和C端，构建出具有荧光能量转移特性的功能蛋白YDC；同时利用能特异性切割DdrO的耐辐射奇球菌损伤响应调控因子PprI蛋白，将PprI蛋白的91号位点的天冬氨酸（D）突变为丙氨酸（A）后得到蛋白PprI‑D91A，以降低其不存在单链DNA时的酶切活性；当体系中存在损伤产生的单链DNA时，PprI‑D91A能够快速地酶切YDC，在440 nm激发光的作用下，YDC发射光的480 nm峰升高且530 nm峰下降；同时还提供了YDC和PprI‑D91A的氨基酸序列以及检测DNA损伤的反应体系。本发明对开发新型分子生物学的工具具有重要指导意义。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是一种检测DNA损伤的荧光检测方法及功能蛋白。

背景技术

目前检测DNA损伤的方法根据实验原理可以分为三大类：根据DNA理化性质改变设计的检测方法、根据分子互作原理设计的检测方法、以及根据损伤后物质变化设计的检测方法。单细胞凝胶电泳法（SCGE，也称为彗星实验）就是一种根据DNA理化性质改变设计的检测方法，能有效地测定细胞中DNA单链和双链的损伤程度，主要步骤包括封装、裂解和电泳三步，高pH下电泳形成类似彗星的结构。而DNA断裂荧光原位杂交（DBD-FISH）是基于分子杂交原理的，利用碱性条件使DNA在断裂处解旋成单链DNA，再利用荧光DNA探针杂交以展示断裂处。根据物质变化检测的方法有γ-H2AX检测法，γ-H2AX为DNA损伤的一个标志物，一旦发生DNA双链断裂（DSB），就会立即产生γ-H2AX，并且与DSB的数量呈现一一对应的关系，即一个γ-H2AX焦点对应一个DSB位点。

但是在如前所述的DNA损伤检测方法中，前两种的处理步骤较为繁琐，等待时间长，不利于提高实验效率。最后一种虽然能够实现特异性很好的损伤检测，但是依赖于特定蛋白，不利于技术的推广使用。

最新的研究表明，耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans，DR）采取了与经典细菌SOS系统不同的损伤响应修复途径——PprI-DdrO途径，其中发挥关键作用的是PprI和DdrO两个蛋白，并且ssDNA的加入能够促进其中的酶切过程。

发明内容

为了克服现有DNA损伤检测技术的不足，本发明的目的是提供一种基于FRET的DNA损伤检测方法及功能蛋白。

一种基于FRET的DNA损伤检测方法，步骤如下：

1）配制反应溶液，包括：PprI-D91A、YDC、待测样品、Buffer；37℃反应30 min；

2）反应完成后吸取反应溶液加入到黑色386孔板中，利用多功能酶标仪，以440 nm波长的光为激发光，扫描460 nm ~ 600 nm波长的发射光，求得530 nm与480 nm发射光的比值R_530/480；

3）将样品的R_530/480与空白对照的R_530/480作比得到rR_530/480，根据标准曲线方程，得到待测样品中所含的ssDNA量，据此来评估待测样品中DNA的损伤程度；

所述的YDC含有eYFP、DdrO和eCFP三个结构区域；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的PprI-D91A，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的方法，更具体的步骤如下：