[发明专利]基于FRET的DNA损伤检测方法及功能蛋白

权利要求书

1.一种基于FRET的DNA损伤检测方法，其特征在于，步骤如下：

1）配制反应溶液，包括：PprI-D91A、YDC、待测样品、Buffer；37℃反应30 min；

2）反应完成后吸取反应溶液加入到黑色386孔板中，利用多功能酶标仪，以440 nm波长的光为激发光，扫描460 nm ~ 600 nm波长的发射光，求得530 nm与480 nm发射光的比值R_530/480；

3）将样品的R_530/480与空白对照的R_530/480作比得到rR_530/480，根据标准曲线方程，得到待测样品中所含的ssDNA量，据此来评估待测样品中DNA的损伤程度；

所述的YDC含有eYFP、DdrO和eCFP三个结构区域；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的PprI-D91A，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：

1）配制反应溶液：PprI-D91A，终浓度0.10 μM；YDC，终浓度3.0 μM；待测样品10 μL；2mM MnCl₂ 10 μL；65.7 μL Buffer；ddH₂O补齐反应溶液到100 μL，37℃反应30 min；

所述的Buffer：250 mM NaCl、5%甘油、20 mM Tris-HCl pH 7.5；

2）反应完成后吸取70 μL反应溶液加入到黑色386孔板中，利用多功能酶标仪，以440nm波长的光为激发光，扫描460 nm ~ 600 nm波长的发射光，求得530 nm与480 nm发射光的比值R_530/480；

3）将样品的R_530/480与空白对照的R_530/480作比得到rR_530/480，根据标准曲线方程，得到待测样品中所含的ssDNA量，据此来评估待测样品中DNA的损伤程度。

3.一种具有荧光能量转移特性的功能蛋白YDC，其特征在于，所述功能蛋白YDC含有eYFP、DdrO和eCFP三个结构区域；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种蛋白酶PprI-D91A，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5. 一种基于FRET的功能蛋白组合，其特征在于，包括PprI-D91A和YDC；所述的PprI-D91A，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的YDC含有eYFP、DdrO和eCFP三个结构区域；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

PprI-D91A能够准确识别功能蛋白YDC的特定序列并对其进行酶切，酶切反应后YDC的荧光能量转移效率降低，ssDNA的加入促进酶切过程的进行。