[发明专利]一种适合沙雷氏菌L-鼠李糖诱导表达系统的应用培养基和培养方法

说明书

本发明公开了一种适合沙雷氏菌L‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基和培养方法，所述应用培养基是在基础培养基中加入NaOH蚀刻的6系铝合金、透性化学试剂和L‑鼠李糖配制而成。本发明利用NaOH蚀刻的6系铝合金切割去除沙雷氏菌表面的多糖糖被，提高鼠李糖扩散进细胞内的效率；透性化学试剂改善细胞被膜的通透性，诱导物鼠李糖的细胞内扩散运输，快速提高细胞内的鼠李糖浓度，诱导表达系统发挥功能。而且本发明结合双温变温‑重复循环培养法，兼顾沙雷氏菌中鼠李糖诱导系统的有效性和高效性，使鼠李糖使用浓度从20g/L降低到了2～10g/L，同时缩短了诱导培养时间，在沙雷氏菌鼠李糖诱导系统广泛化和规模化生产应用方面具有能够降低人力物力和资源消耗成本的潜力。

技术领域

本发明属于微生物技术邻域，具体涉及一种沙雷氏菌的诱导型培养基和培养方法。

背景技术

沙雷氏菌属肠杆菌目耶尔森氏菌科沙雷氏菌属，是一类环境广泛分布的革兰氏阴性细菌，具有产生丰富代谢产物的能力，同时具有条件致病性，是引起医院内感染的主要病原体之一。近年来沙雷氏菌因为上述特性而成为研究热点。现有的以大肠杆菌E.coli为模式的研究技术虽然可以转用到沙雷氏菌研究中，但是由于沙雷氏菌具有其本身的独特性，需要对这些研究技术进行改造升级。其中在沙雷氏菌中可控的诱导基因表达技术具有重要应用意义。

目前常用的革兰氏阴性细菌诱导型启动子有乳糖诱导启动子pLac、阿拉伯糖诱导型启动子paraB、四环素诱导型启动子ptet和鼠李糖诱导启动子prhaB。诱导物乳糖和阿拉伯糖可被宿主细胞代谢利用，难以保持稳定诱导浓度，当细胞生长尤其是高密度细胞发酵的情况下必需随后多次加入大量诱导物，提高了生产成本，此外这些化合物的代谢物其后可能对培养物产生毒害作用。人工诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和脱水四环素(aTC)虽然不能被代谢并由此保证了长期诱导，但是人工合成诱导物非常昂贵并在一些情况下对生物体生长具有不利影响，这使得大规模到工业规模的应用很不经济。

在大肠杆菌中的鼠李糖诱导表达系统，L-鼠李糖通过转运蛋白(RhaT)摄取到细胞中，通过异构酶(RhaA)转换成L-鼠李酮糖(L-rhamnulose)，然后L-鼠李酮糖进一步通过鼠李酮糖1-磷酸酶(RhaB)磷酸化并由醛缩酶(RhaD)水解产生磷酸二羟丙酮和乳醛。基因rhaBAD组成操纵子并在已知的rhaPBAD启动子辅助下转录。鼠李糖系统与其他系统相比区别在于调节需要两个激活因子RhaS和RhaR，这两者组成转录单位并以与rhaBAD相反的方向转录。当L-鼠李糖存在时，RhaR结合rhaPRS启动子并起始其自身表达和RhaS的表达。RhaS一旦由L-鼠李糖活化，接下来作为效应物结合rhaPBAD启动子和rhaT基因的独立rhaPT启动子并活化结构基因的转录。两激活因子的联合造成rhaPBAD启动子异常严格的转录表达控制。阿拉伯糖诱导型araB启动子和鼠李糖诱导型rhaPBAD启动子的比较表明后者受控于更加严格的调节并在无诱导物鼠李糖条件下真正表现出零表型。

虽然鼠李糖诱导表达系统在大肠杆菌中表现优秀，但是在沙雷氏菌中应用时却效率不高。分析成因为：1)沙雷氏菌菌体表面通常包被着多糖，由荚膜多糖和脂多糖组成；2)绝大数沙雷氏菌缺乏L-鼠李糖通过转运蛋白RhaT(197株具有完整基因组序列的沙雷氏菌中，183株菌无rhaT基因)，不能有效地摄取鼠李糖到细胞中发挥诱导物作用。

通过文献查找以及生物信息学分析发现，在197株具有完整基因组序列的沙雷氏菌中，183株菌无rhaT基因，只有14株菌具有rhaT基因，可能发挥协助扩散作用，有利于鼠李糖细胞内摄取。其余无rhaT基因的沙雷氏菌将只能依靠鼠李糖的被动扩散摄取，效率低下；同时分析还发现，绝大多数的沙雷氏菌具有荚膜、O-抗原、细菌纤维素，聚N-乙酰葡萄糖胺等细胞外多糖包被，这些细胞包被进一步限制了鼠李糖的胞内运输。